Caratterizzazione funzionale di una variante in SCN2A che causa encefalopatia epilettica ad esordio infantile precoce

Abstract

Background: NaV1.2 è un canale del sodio voltaggio-dipendente cruciale per la generazione dei potenziali d’azione nei neuroni. Varianti patogenetiche in SCN2A possono causare diversi disturbi del neurosviluppo. Il nostro obiettivo era caratterizzare una variante patogenetica in SCN2A (c.4976C>T; p.A1659V) identificata in tre pazienti con encefalopatia epilettica e dello sviluppo ad esordio infantile precoce (EIEE) e non responsivi a bloccanti del canale del sodio. Metodi: La variante è stata identificata tramite sequenziamento di nuova generazione (NGS) e inserita nel plasmide Pir cmv SCN2A codificante per NaV1.2 mediante mutagenesi sito-diretta. Le cellule HEK293 esprimenti SCN2A wild-type (WT) e mutato (A1659V) sono state colorate con anticorpi anti-PanNaV per immunofluorescenza o lisate per il western blot. L’immunofluorescenza è stata valutata con microscopia a epifluorescenza e confocale. Per la caratterizzazione funzionale, dopo l’espressione di NaV1.2 WT e del mutante A1659V nelle HEK293, le correnti di membrana sono state misurate mediante analisi patch-clamp whole-cell. Risultati: La variante A1659V non influenzava l’espressione del canale, come dimostrato da western blot e immunofluorescenza. Tuttavia, l’espressione del canale mutato induceva una corrente minore e una riduzione dell’80% della densità di corrente rispetto al canale WT. Infine, la variante modificava la cinetica del canale, spostando a sinistra di -10mV la voltaggio-dipendenza di attivazione e spostando di +10mV il voltaggio di metà inattivazione. Conclusioni: Le encefalopatie epilettiche dello sviluppo ad esordio neonatale sono solitamente causate da mutazioni con guadagno di funzione (GOF) nei canali del sodio, con risposta ottimale ai bloccanti dei canali sodio. Il nostro studio indica che i fenotipi gravi possono talvolta derivare da mutazioni con perdita di funzione (LOF). Pertanto, la caratterizzazione funzionale delle proteine canale è cruciale per guidare il trattamento.

Background: NaV1.2, a voltage-gated sodium channel, is crucial for the generation of action potentials in neurons. Pathogenic SCN2A variants, altering the electrophysiological properties of the channel, may cause a broad range of neurodevelopmental disorders. We aimed to characterize a SCN2A pathogenic variant (c.4976C>T; p.A1659V) found in three patients with early infantile developmental and epileptic encephalopathy (EIDEE) and unresponsive to sodium channel blockers. Methods: Next Generation Sequencing (NGS) identified the pathogenic SCN2A variant, which was introduced into the NaV1.2 Pir cmv SCN2A plasmid through site-directed mutagenesis. HEK293 cells expressing wild-type (WT) and mutated (A1659V) SCN2A were stained with anti-PanNaV antibody for immunofluorescence or lysed for western blot analysis. Immunofluorescence was observed using epifluorescence and confocal microscopy. For functional characterization, NaV1.2 WT and A1659V mutant were expressed in HEK293 cells, and membrane currents were measured by whole-cell patch-clamp analysis. Results: SCN2A A1659V mutation did not impact on channel expression, as shown by western blot and immunofluorescence assays. Expression of A1659V induced a smaller current and an 80% decrease in current density compared to the WT channel. Finally, the A1659V variant modified the channel kinetics, resulting in a -10mV leftward shift in the voltage dependence of activation and an approximately +10mV shift in the voltage of half inactivation. Conclusions: Neonatal-onset developmental epileptic encephalopathies are usually caused by gain-of-function (GOF) mutations in sodium channels, responsive to sodium channel blockers. Our study indicates that severe phenotypes can sometimes result from a loss-of-function (LOF) mutation. Thus, functional characterization of the channel protein is crucial for guiding clinical treatment.