Sviluppo di modulatori selettivi per KCC2 per disturbi cerebrali

Abstract

L'equilibrio tra eccitazione e inibizione nel sistema nervoso centrale è fondamentale per il suo sviluppo e ottimale funzionamento. L'alterazione dell'inibizione GABAergica (mediata dal recettore GABA A permeabile al cloro) è stata trovata implicati in diversi disturbi dello sviluppo e psichiatrici. Un ruolo importante nel mantenimento di tale equilibrio è svolto dai co-trasportatori di cloro NKCC1 e KCC2, i principali regolatori dell'omeostasi di questo ione a livello neuronale. Recentemente il laboratorio Cancedda ha concentrato la sua attenzione sul contributo di questi trasportatori all'invecchiamento del sistema nervoso centrale scoprendo un'alterata espressione di KCC2 nell'ippocampo di topi vecchi (24 mesi) che potrebbe essere alla base del deterioramento cognitivo di questi. Il targeting farmacologico del trasportatore da parte del diuretico Furosemide ha portato ad un miglioramento delle capacità cognitive in topi anziani; tuttavia, l’utilizzo di Furosemide per il miglioramento cognitivo è limitato dal suo forte effetto diuretico. Considerando la mancanza di farmaci selettivi per KCC2, i gruppi Cancedda e De Vivo hanno avviato una campagna congiunta di design di nuovi modulatori di KCC2. In questo progetto, sono stata coinvolto nell'analisi degli esperimenti comportamentali condotti su topi, nella quantificazione dell'espressione proteica tramite Western Blot e nel test in vitro della selettività dei composti sintetizzati utilizzando saggi cellulari. Dei composti finora testati, tre hanno mostrato un'attività inibitoria su KCC2 paragonabile al controllo positivo DIOA. L’analisi della relazione tra struttura e attività dei composti su KCC2 e NKCC1 permetterà di apportare ulteriori modifiche alle strutture delle molecole per aumentare la loro selettività.

The balance between excitation and inhibition in the central nervous system is fundamental for its development and optimal functioning, with defective and/or altered GABAergic signalling (through Cl-permeable GABAA receptors) found implicated in diverse neurodevelopmental and psychiatric disorders. A major role in the maintenance of such balance is played by the co-transporters NKCC1 and KCC2, the main regulators of intraneuronal chloride homeostasis. In the past years, the Cancedda’s lab has investigated their involvement in brain conditions like autism and Down syndrome. Recently they focused their attention on the transporters’ contribution to the ageing brain. They found an altered expression of KCC2 in the hippocampus of old mice (24-month-old) compared to young controls and the pharmacological targeting of the transporter by the FDA-approved loop diuretic Furosemide rescued the age-associated cognitive impairment in long-term memory. Nevertheless, chronic administration of Furosemide comes with serious side effects, namely excessive diuresis due to the inhibition of the renal cotransporter NKCC2, therefore hampering the possible repurposing of the drug. Based on previous experience, the Cancedda and De Vivo groups started a joint drug discovery campaign for the design of new KCC2 modulators that would selectively target the transporter, without altering renal functionality. In this project, I have been involved in the analysis of behavioural tasks, in the quantification of protein expression via Western Blot analysis, and in the in vitro testing of compound selectivity and specificity using cell-based assays. Of the compounds synthesized and tested so far, three have shown an inhibitory activity on KCC2 comparable with the positive control DIOA. However, these same compounds still showed an undesired inhibition towards NKCC1. Based on the structure-activity relationships, new compounds will be designed to refine the molecules’ selectivity towards KCC2.