Diagnostica colorimetrica Point-of-care per il rilevamento di contaminazioni microbiologiche nelle acque destinate al consumo umano

Abstract

Questo lavoro di tesi si è proposto di sviluppare un test diagnostico colorimetrico POC per il rilevamento del microrganismo Escherichia coli in acque destinate al consumo umano. Il lavoro vuole dimostrare come una progettazione smart della strategia di analisi permetta di realizzare un test altamente sensibile ed affidabile, ma allo stesso tempo rapido, a basso costo, e che richieda per la sua esecuzione strumentazione e competenze minime. La strategia integra una fase di estrazione del target di DNA genomico batterico semplice e rapida con una fase di LAMP colorimetrica one-pot, che combina una amplificazione del DNA isotermica con una detection basata su una transizione colorimetrica visibile ad occhio nudo. Quindi è stata indagata e proposta una strategia in cui tutte e tre le fasi (estrazione del target, amplificazione e detection) rispondessero ai requisiti di rapidità, basso costo e portabilità. Per questo è stata scelta per la fase di amplificazione del target genomico batterico la tecnica di amplificazione esponenziale isotermica Loop-mediated isothermal amplification (LAMP), che ha consentito di ottenere, in 30 minuti e in maniera altamente specifica, un limite di rilevazione (LOD) di una singola cellula batterica per reazione. Essendo un’amplificazione isotermica, è stato inoltre dimostrato come la reazione possa essere condotta in un dispositivo termico portatile ed economico. Sfruttando l’elevata tolleranza della LAMP, alla presenza di contaminanti, sono state associate due diverse tecniche di estrazione semplici e rapide, una basata sull’utilizzo della resina a scambio cationico Chelex, e l’altra basata sull’azione lisante delle microonde. Infine, per la fase di detection, è stato introdotto l’utilizzo di un colorante sensibile alle variazioni di pH, lo Xylenol Orange (XO), che sfruttando il notevole abbassamento di pH che si verifica in seguito all'amplificazione,permette una rilevazione instrument-free del target, grazie ad un viraggio di colore.

The aim of this thesis work was to develop a POC colorimetric diagnostic test for the detection of the microorganism Escherichia coli in water intended for human consumption. The work wanted to demonstrate how a smart design of the analysis strategy allows to realize a highly sensitive and reliable test, that was at the same time rapid and low cost, and that required minimal instrumentation and skills. The strategy integrates a simple and rapid extraction step of the bacterial genomic DNA target with a one-pot colorimetric LAMP phase, which combines an amplification of isothermal DNA with a detection based on a colorimetric change visible by the naked eye. Therefore a strategy was investigated and proposed in which all three phases (target extraction, amplification and detection) met the requirements of speed, low cost and portability. For this reason the Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) isothermal exponential amplification technique (LAMP) was selected for the amplification phase of the bacterial genomic target, which made it possible to obtain, in 30 minutes and in a highly specific manner, a detection limit (LOD ) of a single bacterial cell for reaction. Being an isothermal amplification, it has also been demonstrated how the reaction can be carried out in a portable and economical thermal device. Taking advantage of the high tolerance of the LAMP, to the presence of contaminants, two different simple and rapid extraction techniques have been associated with it, one based on use of Chelex cationic exchange resin, and the other based on the lysing action of microwaves. Finally, for the detection phase, the use of a pH sensitive dye, the Xylenol Orange (XO), was introduced. This strategy exploits the considerable lowering of pH that occurs after a LAMP amplification, allowing an instrument-free detection, through a color change from fuchsia to yellow, that occurs only in presence of the bacterial contamination.