Caratterizzazione proteomica dinamica della popolazione CD90+ derivata da organoidi retinici umani durante la maturazione e valutazione del suo potenziale per studi di malattia delle cellule gangliari retiniche

Abstract

Le RGC rappresentano la principale popolazione neuronale coinvolta nelle neuropatie ottiche, incluso il POAG. Lo sviluppo di modelli cellulari umani in grado di riprodurre la complessità del microambiente retinico è fondamentale per lo studio dei meccanismi di differenziamento, maturazione e degenerazione delle RGC. Il presente lavoro ha avuto l’obiettivo di caratterizzare il profilo proteomico delle sottopopolazioni CD90⁺ e CD90⁻ derivate da organoidi retinici ottenuti da hiPSC. Le due frazioni sono state isolate mediante FACS da organoidi differenziati per 28 (T28) e 35 giorni (T35) e sottoposte ad analisi proteomica mediante nanoscale liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (nLC-MS/MS). I risultati hanno evidenziato una progressiva divergenza molecolare tra le popolazioni CD90⁺ e CD90⁻, con un marcato aumento delle proteine differenzialmente espresse a T35. Nella popolazione CD90⁺ a T35 sono risultati arricchiti processi associati alla maturazione neuroretinica, allo sviluppo delle proiezioni neuronali, all’organizzazione delle connessioni sinaptiche e al differenziamento neurogliale. L’analisi dei marcatori associati alle RGC ha evidenziato una progressione verso stadi maturativi più avanzati. Sono stati inoltre identificati marcatori associati ad astrociti e microglia, confermati mediante immunofluorescenza, che ha evidenziato cellule BRN3a⁺/TUBB3⁺, GLAST-1⁺ e IBA1⁺ dopo una settimana di coltura. Infine, l’identificazione di numerose proteine associate al POAG e la loro modulazione temporale suggeriscono la rilevanza del modello per lo studio della malattia. Nel complesso, i risultati supportano l’impiego degli organoidi retinici derivati da hiPSC per lo studio della maturazione delle RGC, delle interazioni neuro-gliali e dei meccanismi coinvolti nelle neuropatie ottiche, in particolare nel glaucoma.

Retinal ganglion cells (RGCs) represent the main neuronal population involved in optic neuropathies, including primary open-angle glaucoma (POAG). The development of human cellular models capable of recapitulating the complexity of the retinal microenvironment is essential for investigating the mechanisms underlying RGC differentiation, maturation, and degeneration. This study aimed to characterize the proteomic profile of CD90⁺ and CD90⁻ subpopulations derived from hiPSC-derived retinal organoids. The two fractions were isolated by FACS from organoids differentiated for 28 (T28) and 35 days (T35) and subjected to proteomic analysis by nanoscale liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (nLC-MS/MS). The results revealed a progressive molecular divergence between CD90⁺ and CD90⁻ populations, with a marked increase in differentially expressed proteins at T35. In the CD90⁺ population at T35, processes associated with neuroretinal maturation, neuronal projection development, synaptic connection organization, and neuroglial differentiation were enriched. Analysis of RGC-associated markers revealed a progression toward more advanced maturation stages. Markers associated with astrocytes and microglia were also identified and confirmed by immunofluorescence, which revealed BRN3a⁺/TUBB3⁺, GLAST-1⁺, and IBA1⁺ cells after one week of culture. Finally, the identification of numerous proteins associated with POAG and their temporal modulation suggests the relevance of this model for disease research. Overall, these findings support the use of hiPSC-derived retinal organoids to investigate RGC maturation, neuroglial interactions, and the mechanisms underlying optic neuropathies, particularly glaucoma.