Sviluppo e convalida di un metodo analitico HPLC per la determinazione della melatonina in integratori alimentari e relativa convalida di processo

Abstract

La melatonina è un metossi-indolo sintetizzato e secreto principalmente dalla ghiandola pineale durante la notte, in condizioni di alternanza luce/buio. Il ritmo endogeno di secrezione è generato dal nucleo soprachiasmatico e regolato dal fotoperiodo. La sua funzione primaria è trasmettere informazioni sul ciclo luce-oscurità alle strutture corporee; inoltre è fondamentale per la regolazione del ritmo sonno–veglia. Poiché il sistema che ne controlla la secrezione è complesso, diverse condizioni possono alterarla, aumentando il rischio di malattie o influenzandone il decorso. Sono quindi disponibili integratori alimentari a base di melatonina, formulati per supportare il ritmo sonno–veglia e attenuare i sintomi del jet lag. Su tali prodotti, nell’Unione Europea, vigono limiti di concentrazione stabiliti dal regolamento (UE) n. 432/2012 (16 maggio 2012) e, con la Circolare del 25 giugno 2013, il Ministero della Salute italiano ha limitato a 1 mg la melatonina negli integratori per distinguere l’uso fisiologico da quello terapeutico. La valutazione del contenuto di melatonina nel prodotto finito è un requisito fondamentale e richiede un metodo analitico in grado di quantificarla e verificarne la conformità alle specifiche dichiarate. A tal fine si è utilizzata la metodica HPLC con sistema Vanquish™ Flex (Thermo Fisher Scientific) e colonna Luna™ Omega 5 μm Polar C18, 250 × 4,6 mm (Phenomenex™). Lo scopo del presente progetto è stato sviluppare un metodo HPLC specifico. Il metodo è stato elaborato e validato secondo le linee guida ICH Q2 (R2) e successivamente applicato, nell’ambito della convalida di processo, all’analisi dei prodotti semilavorati e finiti. I risultati della convalida hanno dimostrato che il metodo è specifico, preciso, lineare, accurato e riproducibile; l’applicazione in convalida di processo ha confermato che i prodotti rispettano le specifiche dichiarate. La ricerca è stata svolta presso il laboratorio di Controllo Qualità dell’azienda ESI S.r.l.

Melatonin is a methoxy-indole synthesized and secreted mainly by the pineal gland at night under normal light–dark conditions. The endogenous secretion rhythm is generated by the suprachiasmatic nucleus and regulated by the photoperiod. Its primary function is to convey information on the light–dark cycle to the body; moreover, it plays a key role in regulating the sleep–wake cycle. Because the mechanisms controlling melatonin secretion are complex, several conditions may affect it, increasing the risk of disease or influencing its course. Accordingly, dietary supplements containing melatonin are available and are formulated to support the sleep–wake cycle and to alleviate jet lag symptoms. In the European Union, these products are subject to concentration limits established by Regulation (EU) No 432/2012 (16 May 2012). In Italy, the Ministry of Health Circular of 25 June 2013 further set a maximum melatonin content of 1 mg in supplements to distinguish physiological from therapeutic use. Therefore, assessing melatonin content in the finished product is a fundamental requirement and calls for an analytical method capable of quantifying melatonin and verifying compliance with the declared specifications. To this end, an HPLC method was employed using a Vanquish™ Flex system (Thermo Fisher Scientific) and a Luna™ Omega 5 μm Polar C18 column (250 × 4.6 mm; Phenomenex™). The aim of this project was to develop a specific HPLC method. The method was developed and validated in accordance with the ICH Q2 (R2) guidelines and subsequently applied, within process validation, to the analysis of semi-finished and finished products. Validation results demonstrated that the method is specific, precise, linear, accurate, and reproducible; its application during process validation confirmed that the products comply with the declared specifications. The research was carried out at the Quality Control laboratory of ESI S.r.l.