Rilascio della proteina prionica mediante vescicole extracellulari in cellule neuronali A1: dall'ottimizzazione del protocollo di purificazione al controllo farmacologico con modulatori vegetali dell'autofagia

Abstract

Le malattie prioniche sono forme neurodegenerative, caratterizzate dalla trasformazione della proteina prionica (PrPC) nella forma “scrapie” (PrPSC) e dal suo accumulo e nel sistema nervoso centrale. Le forme umane includono la malattia di Creutzfeldt-Jacob, Gerstmann-Sträussler-Scheinker, l'insonnia familiare fatale e Kuru a patogenesi familiare, sporadica, trasmissibile o iatrogena. La diffusione della PrPSc al cervello sfrutta vescicole extracellulari (EVs), che promuovono la neuroinvasione. Le malattie prioniche condividono al pari di altre malattie neurodegenerative più conosciute, come Alzheimer, il morbo di Parkinson e la sclerosi laterale amiotrofica, sono caratterizzate dall'accumulo di materiale amiloidogenico nel tessuto cerebrale. Tutti questi tipi di malattie neurodegenerative sono definite proteinopatie, favorite dalla compromissione della proteostasi nei neuroni, che porta all'accumulo di materiale amiloidogenico e conseguente morte neuronale. L'autofagia è un meccanismo principali per liberare il citoplasma da aggregati ed evitare l'apoptosi; la sua alterazione è una caratteristica tipica del tessuto cerebrale contenente PrPSc. Il controllo del processo di autofagia e della neurodiffusione della PrPSc può rappresentare un approccio terapeutico innovativo. Poiché il percorso di formazione della PrPSc segue le stesse fasi della PrPC, è stato proposto che la modulazione del traffico della PrPSc possa essere bersaglio terapeutico. Lo scopo della tesi è comprendere come la modulazione farmacologica dell'autofagia può modificare il rilascio di PrPC negli EV nella linea cellulare neuronale A1. Questo intervento farmacologico si concentra principalmente su due composti vegetali definiti come possibili agenti neuroprotettivi: l'acido ursolico e il trealosio. Inoltre, abbiamo migliorato il protocollo di isolamento degli EV per ottenere un campione di EV più arricchito per ottenere un campione di EV più arricchito per l'analisi del PrPC.

Prion diseases are lethal progressive neurodegenerative diseases, characterized by prion protein (PrPC) transformation into “scrapie” form (PrPSC) and it’s accumulation and spreading throughout the central nervous system. Human forms include Creutzfeldt-Jacob disease, Gerstmann-Sträussler-Scheinker syndrome, fatal familial insomnia and Kuru. Pathogenesis is familiar, sporadic, transmissible or iatrogenic. The main hypothesis propose PrPSc spreading to the brain into extracellular vesicles (EVs), that also promote neuroinvasion. Prion diseases share many clinical symptoms with the most known neurodegenerative diseases – such as Alzheimer’s disease, Parkinson disease and amyotrophic lateral sclerosis - they are also characterized by the accumulation of amyloidogenic material in the brain tissue. All these types of neurodegenerative diseases are defined as proteinopathies. At the basis of proteinopathies there is an impairment of proteostasis processes in neuronal cells, which lead to amyloidogenic material accumulation and subsequent neuronal death. Autophagy is one of the most important mechanisms to clear cytoplasm from aggregates and avoid apoptosis. Patients suffering of neurodegenerative diseases show a marked imbalance of autophagy flux, leading to the progression of the disease. The control of autophagy process and PrPSc neurodiffusion could be an innovative therapeutical approach. Since PrPSc pathway of formation follows the same steps of PrPC, it has been proposed that the modulation of PrPSc trafficking could represents a target for therapy. The aim of this thesis is to understand how pharmacological modulation of autophagy can modify PrPC release in EVs in neuronal cell line A1. This pharmacological intervention focuses mainly on two plant-derived compounds recently defined as possible neuroprotective agents ursolic acid and trehalose. Also, we improved EVs isolation protocol to obtain the more enriched-EVs sample for PrPC analysis.