Caratterizzazione del meccanismo di riparazione del DNA per escissione nucleotidica in cellule staminali di gliomi di alto grado mediante microscopia confocale e manipolazione genetica

Abstract

I gliomi di alto grado rappresentano la forma più aggressiva e letale di tumori cerebrali primari negli adulti, caratterizzati da una crescita rapida, un’infiltrazione estesa nei tessuti cerebrali sani, un’elevata eterogeneità genetica e una marcata resistenza alle terapie convenzionali. Negli ultimi anni, evidenze crescenti hanno messo in luce il ruolo di una sottopopolazione di cellule tumorali con proprietà simili a quelle delle cellule staminali, note come cellule staminali del glioma (GSC, glioma stem cells), nel promuovere la progressione della malattia, la recidiva del tumore e la resistenza terapeutica. Le GSC mostrano una maggiore capacità di autorinnovamento, una plasticità differenziativa e un’aumentata capacità di risposta al danno al DNA.

Questa tesi ha indagato il meccanismo di riparazione per escissione di nucleotidi (NER, Nucleotide Excision Repair) nelle GSC, confrontandole direttamente con le loro controparti differenziate. Tramite saggi funzionali, è stata dimostrata una maggiore efficienza delle GSC nel riconoscere e riparare le lesioni al DNA indotte da raggi UV rispetto alle cellule differenziate. Inoltre, è stato messo a punto un sistema di editing genetico basato su CRISPR-Cas9 per generare linee cellulari knockout per il gene XPC, essendo XPC un attore chiave nella sotto-via del NER detta Global Genome NER (GG-NER); è stato inoltre sviluppato un costrutto di fusione XPC-GFP per studiare la dinamica in vivo della proteina durante la riparazione.

Questi risultati forniscono nuove conoscenze sui meccanismi di resistenza delle GSC e pongono le basi per lo sviluppo di strategie terapeutiche più efficaci contro i gliomi.

High-grade gliomas represent the most aggressive and lethal form of primary brain tumors in adults, characterized by rapid growth, extensive infiltration into healthy brain tissue, genetic heterogeneity, and marked resistance to conventional therapies. In recent years, increasing evidence has highlighted the role of a subpopulation of tumor cells with stem-like properties, known as glioma stem cells (GSCs), in driving disease progression, tumor recurrence, and therapeutic resistance. GSCs exhibit enhanced self-renewal capacity, differentiation plasticity, and an increased ability to respond to DNA damage.

This thesis investigated the Nucleotide Excision Repair (NER) mechanism in GSCs, in direct comparison with their differentiated counterparts. Using functional assays, it has been demonstrated an higher efficiency of GSCs in recognizing and repairing UV-induced DNA lesions compared to differentiated cells. Additionally, a CRISPR-Cas9-based gene editing system was established to generate XPC knockout cell lines, being XPC a key player in the Global Genome NER (GG-NER) sub-pathway; furthermore, an XPC-GFP fusion construct was developed to study the protein in vivo dynamics during repair.

These findings provide novel insights into the resistance mechanisms of GSCs and lay the background for the development of more effective therapeutic strategies against gliomas.