Metabolizzazione della subunità regolatoria della calpaina nei tumori del sistema nervoso centrale.

Abstract

Il sistema delle calpaine, che comprende una famiglia di proteasi calcio-dipendenti, si è rivelato essere sempre più implicato nella progressione tumorale, inclusi tumori cerebrali aggressivi come il glioblastoma (GBM). L'attività delle isoforme ubiquitarie, Calpaina-1 e Calpaina-2, è regolata dalla loro subunità piccola comune (CSS1), che è spesso sovraespressa in condizioni maligne. La funzione della CSS1 sovraespressa all'interno del sistema proteolitico Ca 2+-dipendente e del microambiente tumorale rimane poco chiara. Questa tesi si propone di investigare il processamento della CSS1 e il suo impatto sul sistema calpaina-calpastatina, esplorando la digestione della CSS1 in vitro, in sistemi biochimici purificati e in lisati grezzi di cellule di astrocitoma e glioblastoma, che rappresentano condizioni fisiologicamente più rilevanti. Sono stati condotti saggi in vitro utilizzando calpaine purificate e CSS1 ricombinante (recCSS1) per stabilire se la calpaina-1 e la calpaina-2 possano digerire, oltre alla CSS1 endogena normalmente presente nel complesso CSS1-calpaina, anche la recCSS1 "esogena". La tecnica SDS-PAGE è stata utilizzata come strumento per rilevare la CSS1 digerita. Per verificare se la CSS1 sovraespressa potesse essere clivata in condizioni più fisiologiche, gli stessi esperimenti sono stati replicati utilizzando lisati grezzi di cellule di astrocytoma 1231N1 e recCSS1. Invece della SDS-PAGE, è stata eseguita la zimografia sui lisati grezzi per rilevare, oltre ai complessi CSS1-calpaina e all'attività della calpaina-1 e calpaina-2, anche il clivaggio della CSS1 legata alla subunità catalitica della calpaina. Infine, l'analisi tramite zimografia di cellule derivate da pazienti con GBM ha rivelato pattern di CSS1-calpaina-1 e CSS1-calpaina-2 e profili di attività distinti.

The calpain system, comprising a family of calcium-dependent proteases, was discovered as increasingly implicated in cancer progression, including aggressive brain tumors like glioblastoma (GBM). The activity of the ubiquitous isoforms, Calpain-1 and Calpain-2, is regulated by their common small subunit, (CSS1), which is often overexpressed in malignant conditions. The function of overexpressed CSS1 within the Ca2+-dependent proteolytic system and the tumor microenvironment remains unclear. This thesis aims to investigate the processing of CSS1 and its impact on the calpain-calpastatin system, exploring CSS1 digestion in vitro, in purified biochemical systems, and in crude lysates from astrocytoma and glioblastoma cells representing more physiologically relevant conditions. In vitro assays using purified calpains and recombinant CSS1 (recCSS1) were carried out to establish whether calp-1 and calp-2 can digest, in addition to the endogenous CSS1 normally present in the complex CSS1-calpain, the “exogenous” rec CSS1. SDS-PAGE was used as a tool to detect digested CSS1. To explore if overexpressed CSS1 could be cleaved in more physiological conditions, the same experiments were replicated using crude lysates from 1231N1 astrocytoma cells and recCSS1. Instead of SDS-PAGE, zymography was carried out in crude lysates for detecting, in addition to CSS1-calpain complexes, and activity of calp 1 and calp-2, also cleavage of CSS1 bound to calpain catalytic subunit. Finally, GBM patient-derived cells analyzed by zymography revealed CSS1-calp-1 and CSS1 calp-2 patterns and distinct activity profiles.