Studio longitudinale di diverse condizioni di coltura sull'attività elettrofisiologica di reti neuronali derivate da hiPSCs

Abstract

Le reti neuronali derivate da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hIPSC) offrono una piattaforma promettente per lo studio delle funzioni cerebrali umane in vitro. Tuttavia, la loro complessità e variabilità evidenziano la necessità di protocolli ottimizzati e affidabili per garantire riproducibilità e risultati coerenti. I micro-electrodes arrays (MEAs) forniscono un metodo prezioso per caratterizzare l'attività delle reti neuronali, consentendo un'analisi efficace delle proprietà elettrofisiologiche.

In questa tesi, ho valutato come diverse variabili, inclusi i fattori di adesione, i terreni di coltura e le densità di piastratura, influenzino lo sviluppo e l'attività elettrofisiologica delle reti neuronali derivate da hIPSC. Ho testato otto condizioni di coltura distinte, combinando due fattori di adesione — polietilenimina (PEI) e poli-L-ornitina (PLO) — due terreni di coltura, BrainPhys e Neurobasal, e due densità di piastratura, 1200 cellule/mm² e 4800 cellule/mm². La mia analisi ha spaziato dal calcolo delle metriche e dalla valutazione dei pattern di firing, inclusi il livello di burstiness e altre misure legate ai burst, fino allo studio delle dinamiche di rete attraverso l'analisi dei network burst.

Ho condotto una valutazione completa dello sviluppo e della maturazione delle reti nel tempo, esaminando sia l'attività intra- che inter-rete per fornire una caratterizzazione più chiara di come le diverse condizioni di coltura influenzino il comportamento delle reti neuronali. Questo lavoro contribuisce allo sviluppo di protocolli più standardizzati e riproducibili per le colture neuronali derivate da hIPSC, un passo essenziale per far progredire lo studio delle neuropatologie, la prototipazione di farmaci e la medicina personalizzata, dove modelli neuronali specifici per il paziente possono offrire approcci terapeutici su misura.

Human-induced pluripotent stem cell (hIPSCs) derived neuronal networks offer a promising platform for studying human brain function in vitro. However, their complexity and variability highlight the need for optimized and reliable protocols to ensure reproducibility and consistent results. Micro-electrode arrays (MEAs) provide a valuable method for characterizing neuronal networks activity, enabling a powerful analysis of electrophysiological properties.

In this thesis, I evaluated how various factors, including coating types, culture media, and plating densities, influence the development and electrophysiological activity of hIPSC-derived neuronal networks. I tested eight distinct culture conditions, combining two coatings — Polyethyleneimine (PEI) and Poly-L-Ornithine (PLO) — two culture media, BrainPhys and Neurobasal, and two plating densities of1200 cells/mm² and 4800 cells/mm². My analysis spanned from the calculation of firing parameters and the assessment of firing patterns, including burstiness and burst-related metrics, to the study of network dynamics through network bursting analyses.

I conducted a comprehensive evaluation of network development and maturation over time, examining both intra- and inter-network activity to provide a clearer characterization of how different culture conditions affect neuronal network behavior. This work contributes to the development of more standardized and reproducible protocols for hIPSC-derived neuronal cultures, an essential step for advancing the study of neurological diseases, drug screening, and personalized medicine, where patient-specific neuronal models could offer tailored treatment approaches.