Effetto della Vitamina D sulla polarizzazione di macrofagi M1 in colture primarie

Abstract

Introduzione: I macrofagi svolgono un ruolo fondamentale nella patogenesi di diverse patologie autoimmuni reumatologiche, quali l’artrite reumatoide o la sclerosi sistemica; e in base al microambiente in cui si trovano possono polarizzare verso un fenotipo proinfiammatorio (M1) o antinfiammatorio (M2). Numerosi studi hanno evidenziato un ruolo regolatorio della vitamina D (1,25(OH)2D3) nella risposta immunitaria. Questo studio ha il principale obbiettivo di valutare gli effetti della vitamina D nell’indurre un fenotipo M2 in macrofagi M1 derivati da monociti (M1-MDM).

Metodi: MDM ottenuti da cellule mononucleate di sangue periferico di 7 soggetti sani (HS) dopo una stimolazione di 24h con PMA (5ng/ml), sono stati stimolati con LPS (1 μg/ml) per 24 ore per indurli verso un fenotipo M1 (M1-MDM). Gli M1-MDM sono stati poi trattati con e senza 1,25(OH)2D3 alla concentrazione di 10 e 100nM per 24 e 48 ore sempre in presenza di stimolazione con LPS. L’espressione genica di CD204, CD163, CD206 (marker M2), MerTK (marker M2 funzionale coinvolto nel processo fibrotizzante), CD80 (marker M1) e di VDR è stata valutatata tramite qRT-PCR, mentre la sintesi proteica dei marker M2 è stata indagata tramite Western blotting. L’analisi statistica è statata eseguita con il Wilcoxon t-test.

Risultati: La 1,25(OH)2D3, soprattutto alla concentrazione di 100nM, ha aumentato l’espressione genica e la sintesi proteica di CD204 (p=0.13; p<0.05) e CD206 (p=0.13), nonché la sola espressione genica di CD163, rispetto ai macrofagi trattati con solo LPS a 48 ore di trattamento. Contrariamente, il trattamento con 1,25(OH)2D3 ha ridotto l’espressione genica di MerTK sia a 24 ore (p=0.13 a 10nM; p=0.13 100nM) che a 48 ore (p=0.06 a 100nM).

Discussione: La 1,25(OH)2D3 sembra promuovere in vitro lo shift dei macrofagi M1 a M2, e potrebbe quindi svolgere oltre a quello immunoregolatorio anche un ruolo antifibrotico, inducendo la downregolazione del recettore tirosin chinasi (MerTK).

Introduction: Macrophages play a pivotal role in the pathogenesis of various autoimmune rheumatologic diseases, such as rheumatoid arthritis and systemic sclerosis. Depending on the microenvironment in which they are found, they can polarize either toward a proinflammatory (M1) or an anti-inflammatory (M2) phenotype. Numerous studies have demonstrated an immunoregulatory role of vitamin D (1,25(OH)2D3). The primary aim of this study is to evaluate the effects of vitamin D in inducing an M2 phenotype in M1 monocyte-derived macrophages (M1-MDMs).

Methods: MDMs were obtained from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of 7 healthy subjects (HS) after a 24 hours stimulation with PMA (5ng/ml). Subsequently, they were stimulated with LPS (1 μg/ml) for 24 hours to polarize them toward an M1 phenotype (M1-MDMs). These M1-MDMs were then treated with and without 1,25(OH)2D3 at concentrations of 10 and 100nM for 24 and 48 hours, while maintaining LPS stimulation. Gene expression of CD204, CD163, CD206 (M2 marker), MerTK ( a functional M2 marker involved in fibrosis), CD80 (M1 marker), and VDR was assessed by qRT-PCR, while protein synthesis of M2 markers was investigated by Western blotting. Statistical analysis was performed using the Wilcoxon t-test.

Results: 1,25(OH)2D3, especially at a concentration of 100nM, increased the gene expression and protein synthesis of CD204 (p=0.13; p<0.05) and CD206 (p=0.13), as well as the gene expression alone of CD163, compared to macrophages treated with LPS alone after 48h of treatment. In contrast, treatment with 1,25(OH)2D3 reduced MerTK gene expression at both 24 h (p=0.13 at 10nM; p=0.13 100nM) and 48 h (p=0.06 at 100nM).

Discussion: 1,25(OH)2D3 appears to promote the in vitro shift of M1 macrophages to M2, and may also play an antifribrotic role in addition to its immunoregulatory one by inducing the downregulation of the receptor tyrosine kinase (MerTK).