Studio della plasticità neuronale attività-dipendente nel cervelletto di topo tramite il disegno e utilizzo di vettori virali e tecniche di immunoistochimica

Abstract

La corteccia cerebellare è un'area del sistema nervoso centrale con un ruolo chiave nell'apprendimento e nel controllo motorio; qui è stato dimostrato che molte forme di plasticità funzionale e strutturale contribuiscono a codificare i ricordi. Come primo obiettivo, ho studiato il ruolo svolto dall'attività elettrica delle fibre rampicanti (CF) nella regolazione della spinogenesi sui dendriti prossimali delle cellule di Purkinje (PC). Le PC hanno dendriti prossimali che sono innervati dalle CF e con bassa densità di spine rispetto a quelli distali. Ho analizzato campioni di topi trattati con vettori lentivirali in grado di ridurre l'espressione dei canali del sodio voltaggio-dipendenti NaV1.6 e 1.1/1.2. e iniettati nel nucleo olivare inferiore. I dati ottenuti rivelano che l'attività delle CF esercita un'azione inibitoria sulla spinogenesi sul territorio dendritico che innervano sulla loro PC target. Come secondo obiettivo, ho valutato il ruolo dell'eccitabilità delle PC sul circuito cerebellare, concentrandomi sull'innervazione delle CF e sulla perdita di PC in funzione dell'età. Sono considerati due lobuli cerebellari: il 3 e il 10, rispettivamente negativo e positivo per l'espressione di zebrinaII, e caratterizzati da un firing alto e basso. Ho studiato l'effetto di una mutazione knock-out dei canali K+ dipendenti dal Ca2+ di tipo SK2, selettiva per le PC (L7SK2). In questo caso, l'eccitabilità intrinseca delle PC è aumentata e la differenza nell'attività spontanea specifica del lobulo è assente. Indipendentemente dal genotipo, il lobulo 10 è caratterizzato da una maggiore densità di varicosità delle CF. I risultati ottenuti mostrano anche una tendenza all'aumento della densità di PC nei topi L7SK2, suggerendo che i canali SK2 potrebbero essere coinvolti nella neurodegenerazione dipendente dall'età. Come terzo obiettivo, ho progettato e generato vettori lentivirali per lo studio in vivo dell'attività spontanea delle CF mediante microscopia a due fotoni del Ca2+.

The cerebellar cortex is an area of the central nervous system (CNS) that plays a key role in motor learning and control; here many forms of functional and structural plasticity have been shown to contribute to encode memories. As first aim, I have investigated the role played by climbing fibers (CFs) electrical activity in the regulation of spinogenesis on Purkinje cells (PCs) proximal dendrites. PCs have proximal dendrites which are innervated by CFs and are characterized by a low spine density compared to distal ones. Previous studies suggested that these fibers could repress spine growth locally. For my purpose, I analyzed samples of mice treated with lentiviral vectors able to reduce the expression of the voltage-dependent sodium channels NaV1.6, and 1.1/1.2. and injected in the inferior olivary nucleus, where CFs generate. The data obtained reveal that CFs activity exerts an inhibitory action on spinogenesis specifically on the dendritic territory that they innervate on their PC target. As second aim, I assessed the role of PCs excitability on the cerebellar circuit, focusing on CFs innervation and on the age-dependent loss of PCs. Two cerebellar lobules were taken into consideration: lobule 3 and lobule 10, negative and positive for zebrinII expression, which are characterized by a high and a lower spontaneous activity. I investigated the effect of a knock-out mutation of SK2-type Ca2+-dependent K+ channels selective for PCs (“L7-SK2”). Here, PCs intrinsic excitability is increased and the difference in the lobule-specific spontaneous activity is absent. Independently from the genotype lobule 10 is characterized by a higher density of CFs varicosities. The results obtained also show a trend towards an increase in PCs density in L7-SK2 mice, suggesting that SK2 channels could be involved in age-dependent neurodegeneration. As third aim, I designed and generated lentiviral vectors for the in vivo study of CFs spontaneous activity by two-photon Ca2+-microscopy.