Studio dell'espressione e funzione del canale del cloro acido-dipendente TMEM206

Abstract

TMEM206 è stato recentemente identificato come l’identità molecolare del canale acido- dipendente del cloruro, con ruoli in membrana plasmatica e a livello intracitoplasmatico. Le informazioni disponibili sono alquanto limitate, poiché la maggioranza degli studi sono stati condotti su roditori. Avendo presente ciò, ci siamo concentrati sul comprendere meglio dal punto di vista spaziale e funzionale questo canale utilizzando tessuti umani ex-vivo e cellule in-vitro. Per la caratterizzazione spaziale, sia a livello tissutale che di singola cellula, ci siamo avvalsi di tecniche quali RT-PCR, RNAscope, BASEscope e immunofluorescenza, rivelando l’esistenza di due differenti isoforme di TMEM206. L’isoforma 2, o corta (poiché non possiede l’esone 2), è stata identificata in tutti i tessuti analizzati e principalmente localizza a livello endocitico. L’espressione dell’isoforma 1 invece è specifica per il cervello e le sue diverse aree, sia in cellule neuronali che gliali, localizzandosi maggiormente a livello del Golgi. Dal punto di vista biochimico è stata rilevata una maggiore espressione e stabilità dell’isoforma 2 rispetto alla 1. Per quanto riguarda la caratterizzazione funzionale, abbiamo condotto esperimenti che miravano sia all’attività di membrana, come il saggio basato su HS-YFP e il saggio della morte indotta da acido, che a quella intracellulare, andando a misurare il pH endosomiale. I primi hanno rivelato che l’isoforma 1 è risultata maggiormente attiva, nonostante la sua minore espressione. Invece per quanto riguarda l’isoforma 2 si è riscontrata una sua maggiore attività nel controllo del pH endosomiale, in particolare frenandone l’eccessiva acidificazione. Future ricerche dovranno indagare ulteriormente l’attività che questo canale ha nel cervello, sia dal punto di vista fisiopatologico che come possibili nuovi approcci terapeutici per patologie caratterizzate da acidosi tissutale, come ictus ischemico, cancro e disordini dei processi infiammatori.

TMEM206 is a recently identified proton-activated outwardly rectifying chloride channel, a type of channel with roles in plasmamembrane and intracellular compartments. The current knowledge regarding this channel is quite limited in human, also because the majority of studies were conducted in rodents. So, we focused to characterize it at the spatial expression and functional levels in human native tissues and in vitro. The spatial characterization at organ, tissue, and single cell levels by RT-PCR, RNAscope, BASEscope, and immunofluorescence revealed intriguing differences between two existing isoforms of TMEM206. The isoform 2, or short (it lacks the exon 2), was found highly expressed in all analyzed tissues and mainly localized in the endocytic compartment. The expression of the isoform 1, or long, was instead found restricted to the brain, in different regions, and in both neuronal and glial cells; at the cellular level it was found more in the Golgi network. Biochemical assays indicated a higher production and stability of the isoform 2 over the isoform 1, when expressed in human cells. Regarding the functional characterization, we performed both experiments related to the plasmamembrane activity, as the HS-YFP assay and the acid-induced cell death assay, and the intracellular activity, by measuring the endosomal pH. The former revealed a higher contribution of the isoform 1, also despite its lower expression level with respect to isoform 2. Instead, isoforms 2 resulted more involved in the regulation of endosomal pH, acting as a brake to prevent excessive acidification. For future perspective, these results suggest that further investigation regarding the brain may be interesting, also for new pathological knowledge and therapeutic strategies about diseases characterized by tissue acidosis as ischemic stroke, cancer, and inflammation disorders.