Studio dell'interazione dei linfociti T Vδ2 con linee primarie di glioblastoma

Abstract

Il glioblastoma (GBM) è il più comune tumore cerebrale incurabile, per cui sono necessari nuovi approcci terapeutici. La sua aggressività deriva dall’overespressione del recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR), un potenziale bersaglio terapeutico. Poiché l'anticorpo monoclonale anti-EGFR Cetuximab (CET) non è efficace nell'eliminare le cellule del GBM, abbiamo utilizzato questo anticorpo coniugato con l'aminobisfosfonato acido zoledronico (CET-ZA ADC). Lo ZA è in grado di stimolare la proliferazione e differenziazione delle cellule T Vδ2 da cellule naïve a linfociti effettori, con attività antitumorale. Con la citometria a flusso, abbiamo visto che le linee cellulari primarie di GBM esprimono sia l'EGFR che le butirrofilline, necessarie per l'attivazione delle cellule T Vδ2, in presenza di ZA. Il CET-ZA entra nelle cellule GBM e colocalizza con LAMP1, suggerendo il suo processamento nei lisosomi. L'ADC CET-ZA è stato in grado di stimolare la proliferazione delle cellule T Vδ2 da PBMC in coculture con GBM. Tuttavia, questa proliferazione è stata abolita quando il GBM è stato cocoltivato solo con monociti e cellule T purificate. Ciò suggerisce che il GBM può educare i monociti a cellule immunosoppressive e/o che all'interno delle PBMC sono presenti altri tipi cellulari, come le cellule NK. Per analizzare se il CET-ZA può innescare l’attività citolitica delle cellule T Vδ2, abbiamo utilizzato la colorazione con cristalvioletto, valutazione del contenuto di ATP e marcatura con una sonda fluorescente, che penetra nelle cellule morte o danneggiate. Il CET-ZA può aumentare l'effetto citotossico basale del GBM da parte delle cellule T Vδ2. Tuttavia, lo ZA solubile è risultato più efficiente nell'uccidere le cellule GBM. Complessivamente, questi risultati suggeriscono che la CET-ZA può essere uno strumento utile per innescare l'attività anti-GBM con il vantaggio di colpire specificamente le cellule tumorali rispetto al forte tropismo midollare dello ZA solubile.

Glioblastoma (GBM) is the most common incurabile brain tumor so new therapeutic approaches are needed. The aggressiveness of GBM is associated with overexpression of epidermal growth factor receptor (EGFR) representing a suitable therapeutic target. Since the anti-EGFR monoclonal antibody Cetuximab (CET) is not efficient in eliminating GBM cells, we set forth to utilizing this antibody conjugated with the aminobisphosphonate zoledronic acid (CET-ZA ADC). This latter drug is able to stimulate Vδ2 T cell proliferation and differentiation from naïve cells to effector lymphocytes displaying a strong antitumor activity. Using flow cytometry, we found that GBM primary cell lines expressed both EGFR and butyrophyllins. The latter molecules are needed for Vδ2 T cells activation triggered by the uptake of ZA. Indeed, the CET-ZA enterd GBM cells and apparently colocalized with LAMP1 suggesting this antibody is processed into lysosomes. Importantly, the CET-ZA ADC was able to stimulate Vδ2 T cells proliferation from PBMC in cocultures with GBM cells. However, this proliferation was abolished when GBM were co-cultured with only monocytes and purified T cells. This suggests that GBM can educate monocytes to immunosuppressive cells and/or within PBMC are present other cell types such as NK cells that can overcome the GBM-mediated effect. Furthermore, we analysed whether CET-ZA can trigger anti-tumor GBM cytolysis exherted by Vδ2 T cells. To assess cytolysis, we used different methods including crystal violet staining, evaluation of ATP content, and labelling with a green fluorescent probe, which penetrates dead or damaged cells. CET-ZA can increase the basal GBM cytotoxic effect of Vδ2 T cells. However, soluble ZA was more efficient in killing GBM cells. Altogether, these findings suggest that CET-ZA can be an useful tool to trigger anti-GBM activity with the advantage to target specifically tumor cells compared to the strong bone marrow tropism of soluble ZA.