Verso modelli cerebrali in vitro: dalle culture 2D a quelle 3D

Abstract

L'obiettivo principale di questa tesi consiste nello sviluppo e caratterizzazione di reti 2D e 3D in vitro formate da neuroni, differenziati da cellule staminali pluripotenti indotte umane (human-induced pluripotend stem cell, i.e. h-iPSC), in co-coltura con astrociti corticali di ratto. La coltura 3D è garantita dall'uso di un idrogel biopolimerico termosensibile, in cui sono incapsulate le cellule. L'attività spontanea delle reti 2D e 3D è stata acquisita in diversi momenti dello sviluppo mediante dispositivi di array di microelettrodi (MEA). È stata valutata ed esplorata la possibilità di utilizzare un sistema di acquisizione basato su sonde, tipicamente utilizzate per le registrazioni in vivo, in grado di penetrare il tessuto 3D. Le attività principali della tesi includono: • Esperimenti in vitro: Esperimenti con colture in vitro 2D e 3D di neuroni e astrociti con acquisizioni di attività elettrofisiologica spontanea tramite array di microelettrodi. • Analisi immagini morfologiche: È stata utilizzata la tecnica dell’imunofluorescenza per marcare e visualizzare i diversi componenti di perte delle colture cellulari e verificare la formazione delle reti. • Elaborazione dei dati: I dati neuronali sono stati elaborati utilizzando algortimi in MATLAB. • Analisi comparativa e interpretazione dei dati: I dati provenienti da colture 2D e 3D sono stati confrontati ed è stato fornito un profilo di sviluppo funzionale per ciascun gruppo sperimentale. Le conoscenze acquisite durante questo progetto aiuteranno a comprendere i fenotipi elettrofisiologici delle colture 2D e 3D e permetteranno di fare un passo avanti verso lo sviluppo di modelli neurali da sfruttare per terapie specifiche per i pazienti.

The main objective of this thesis is the development and characterization of in vitro 2D and 3D networks formed by neurons, differentiated from human induced pluripotent stem cells (human-induced pluripotent stem cells, ie h-iPSC), in co-culture with rat cortical astrocytes. The 3D culture is ensured by the use of a thermosensitive biopolymer hydrogel, in which the cells are encapsulated. Spontaneous activity of 2D and 3D networks was captured at different points in development by microelectrode array (MEA) devices. The possibility of using an acquisition system based on probes, typically used for in vivo recordings, capable of penetrating 3D tissue, was evaluated and explored. The main activities of the thesis include: • In vitro experiments: Experiments with 2D and 3D in vitro cultures of neurons and astrocytes with acquisitions of spontaneous electrophysiological activity by means of microelectrode arrays. • Morphological image analysis: The immunofluorescence technique was used to mark and visualize the different components of the cell cultures and verify the formation of the networks. • Data Processing: Neuronal data were processed using algorithms in MATLAB. • Comparative analysis and data interpretation: Data from 2D and 3D cultures were compared and a profile of functional development was provided for each experimental group. The knowledge gained during this project will help to understand the electrophysiological phenotypes of 2D and 3D cultures and will allow us to take a step towards the development of neural models to be exploited for patient-specific therapies.