Saggio in tempo reale dell'attività ATP sintasica di batteri gram positivi permeabilizzati.

Abstract

Nel presente lavoro di tesi è stato sviluppato un metodo efficiente per misurare in tempo reale il quantitativo di ATP prodotto dalla ATP sintasi batterica. Per misurare l’attività sintetica cellulare di ATP in batteri Gram-positivi, in particolare, in 2 diversi ceppi di Stafilococcus aureus meticillino resistenti (MRSA) e 2 di Stafilococcus epidermidis meticillino resistenti (MRSE), si è modificato un protocollo utilizzato per misurare l’attività di produzione di ATP in tempo reale in batteri Gram-negativi. La combinazione di trattamento con detergente e shock osmotico ha consentito di permeabilizzare la membrana batterica per consentire l’entrata di ADP e l’uscita di ATP. Qust’ultimo è stato quantificato tramite l’ATP Bioluminescence Assay Kit (Roche Diagnostics Corp., Indianapolis, IN) e le misure di luminescenza sono state eseguite con luminometro. La specificità della reazione di ATP sintesi è stata studiata attraverso l’impiego di inibitori specifici: oligomicina e quercetina. Oligomicina è un antibiotico macrolide tossico, classico inibitore di ATP sintasi, essa lega il canale di protoni sul componente Fo, mentre quercetina è un polifenolo che blocca la rotazione della porzione F1 dell’ATP sintasi. Tale metodica può essere utilizzata anche per le specie Gram-negative per saggiare altri principi attivi inibenti l’ATP sintasi. Dallo studio si deduce che quercetina o altri composti correlati inibenti ATP sintasi, possano trovare applicazione come nuove molecole antibatteriche: altri flavoni potrebbero essere utilizzati anche in combinazione a certi antibiotici, oggi ancora attivi sui ceppi MRSA ed MRSE ma dotati di elevata tossicità per aumentarne l’efficacia e diminuirne così gli effetti tossici; se idonei esperimenti confermassero l’eventuale effetto sinergico dei flavoni, essi permetterebbero quando usati in associazione con l’antibiotico, di abbassare la dose del principio attivo, inoltre, tali composti sono noti componenti di una dieta salutistica.

In the present thesis work, an efficient method has been developed to measure in real time the amount of ATP produced by bacterial ATP synthase. To measure the cellular ATP synthetic activity in Gram-positive bacteria, in particular, in 2 different strains of methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and 2 of methicillin resistant Staphylococcus epidermidis (MRSE), a protocol used to measure the ATP was modified real-time ATP production activity in Gram-negative bacteria. The combination of detergent treatment and osmotic shock allowed permeabilization of the bacterial membrane to allow entry of ADP and exit of ATP. The latter was quantified using the ATP Bioluminescence Assay Kit (Roche Diagnostics Corp., Indianapolis, IN) and luminescence measurements were performed with a luminometer. The specificity of the ATP synthesis reaction was studied through the use of specific inhibitors: oligomycin and quercetin. Oligomycin is a toxic macrolide antibiotic and the classic inhibitor of ATP synthase that binds the proton channel on its Fo component, while quercetin is a polyphenol that blocks the rotation of the F1 portion of ATP synthase. This method can also be used for Gram-negative species to test other active ingredients that inhibit ATP synthase. From the study it is deduced that quercetin or other related compounds inhibit ATP synthase, could find application as new antibacterial molecules, other flavones could also be used in combination with certain antibiotics, still active today on MRSA and MRSE strains but endowed with high toxicity to increase their efficacy and thus reducing its toxic effects; if suitable experiments confirmed the possible synergistic effect of the flavones, they would allow, when used in association with the antibiotic, to lower the dose of the active ingredient, moreover, these compounds are known components of a healthy diet.