Colture cellulari 3D in perfusione dinamica

Abstract

La struttura dei tessuti cerebrali è estremamente complessa, quindi la comprensione e la riproduzione rimane ancora una grande sfida nella scienza biomedica. Le colture statiche 3D in vitro sono state ampiamente utilizzate per ricreare strutture morfologicamente e fisiologicamente simili al tessuto in vivo del sistema nervoso centrale (SNC). In condizioni statiche, il trasporto di ossigeno e nutrienti all'interno di colture 3D è compromesso per le strutture di spessore micrometrico, con conseguenti cellule necrotiche nei suoi strati più profondi. A questo proposito, i metodi di cultura 3D dinamici sono molto più affidabili e versatili. L'uso di bioreattori garantisce la riproduzione in vivo dell'apporto di ossigeno e nutrienti alle cellule, consentendo lo sviluppo di colture 3D più spesse. Studi precedenti su modelli 3D del SNC hanno dimostrato che le colture sotto perfusione sono esposte a livelli di stress da taglio, pressione e portata paragonabili a quelli osservati in vivo, influenzando positivamente la sinaptogenesi. La presente tesi mira a sviluppare un modello 3D di tessuto cerebrale coltivato in condizioni dinamiche. A questo scopo è stato utilizzato il bioreattore LiveBox1 (IVtech S.r.l.) con portate costanti e variabili. In primo luogo, un modello 2D standard della rete neuronale è stato coltivato in perfusione per studiare l'impatto delle portate sul suo sviluppo e sinaptogenesi. Questo studio preliminare è stato utilizzato per definire il protocollo di coltura sotto perfusione. Entrambe le cellule differenziate dalle cellule staminali umane pluripotenti indotte (hIPSC) e dalle celle umane del neuroblastoma (SH-SY5Y) sono state incapsulate in un idrogel a base di chitosano e coltivate facendo uso del protocollo definito. I risultati hanno dimostrato che la perfusione ha un impatto importante sulla maturazione delle cellule in colture 2D e che sostiene reti neuronali stabili.

The structure of the brain tissues is extremely complex, therefore understanding and reproducing it remains still a great challenge in biomedical science. Static 3D in vitro cultures have been widely used to recreate structures, morphologically and physiologically similar to the in vivo tissue of the central nervous system (CNS). In static conditions, oxygen and nutrient transport within 3D cultures is compromised for micrometer thick structures, resulting, therefore, in necrotic cells in its deepest layers. In this regard, dynamic 3D culture methods are much more reliable and versatile. The use of bioreactors ensures to reproduce the in vivo oxygen and nutrients supply to the cells, allowing the development of thicker 3D cultures. Furthermore, bioreactors can monitor many culture features such as pH, temperature, flow perfusion rates. Previous studies on 3D models of CNS have shown that cultures under perfusion are exposed to levels of shear stress, pressure, and flow rates comparable to those observed in vivo, positively influencing synaptogenesis. The present thesis aim is to develop a 3D model of brain tissue cultured under dynamic conditions. To this aim, LiveBox1 (IVtech S.r.l.) bioreactor was used with constant and variable flow rates. Firstly, a standard 2D model of neuronal network was cultured under perfusion to study the impact of flow rates on its development and synaptogenesis. This preliminary study was used to define the protocol of culture under perfusion. Both cells differentiated from human-induced pluripotent stem cells (hIPSC) and human neuroblastoma cells (SH-SY5Y) were encapsulated into a chitosan-based hydrogel and cultured using the defined protocol. The results have shown that perfusion has an important impact on cells maturation in 2D cultures and that it sustains stable neuronal networks. To better understand the effect of perfusion on 3D neuronal models, more detailed morphological and functional analysis must be conducted