“Effetto metabolico di IGF-1 mediato dall’isoforma M2 di PK, in un modello di retinopatia diabetica ex-vivo.”

Abstract

La retinopatia diabetica è una comune complicanza microvascolare del diabete. IGF-1 è un potente fattore proangiogenico che agisce nella retina e pertanto è considerato di interesse nelle malattie degenerative di questo tessuto. In questa tesi ho studiato l’effetto di IGF1 su PKM2 a 2, 4 e 24 ore, in un modello ex-vivo di epitelio pigmentato umano, utilizzate come modello di retinopatia diabetica e pertanto coltivate in elevato glucosio (20 Mm). Si è saggiata con spettrofotometria l'attività della PK e della LDH. I risultati mostrano che in elevato glucosio il trattamento delle cellule ARPE-19 con IGF-1 inibisce la PK, aumentando la sua localizzazione nucleare, e decrementando il metabolismo ossidativo, già a 4 ore. Tale decremento resta persistente a 24 ore, sia per quanto riguarda la sintesi di ATP sia per il consumo di ossigeno. La notevole diminuzione di attività della PK, indica che le ARPE-19 esprimono la PKM2, in elevato glucosio. L’attività della LDH, è similmente inibita, complessivamente l’efficienza della glicolisi è diminuita. Si è valutata la fosforilazione ossidativa, anche in presenza di 3 inibitori dei principali substrati metabolici, (BPTES, inibitore della glutamminasi, Etomoxir inibitore della carnitina acil-transferasi, UK5099 inibitore della piruvato deidrogenasi). Il metabolismo ossidativo diminuisce ma ciò non è compensato da un corrispondente aumento del metabolismo anaerobio; infatti, la produzione di lattato non aumenta significativamente e neppure il consumo di glucosio. Il contenuto di ATP diminuisce, e la carica energetica nel complesso si altera, a causa del relativo aumento di AMP che a 24h rimane stabile. Le cellule ARPE-19 in elevato glucosio subiscono una diminuzione globale dell’efficienza della fosforilazione ossidativa, della carica energetica, con scarsa tendenza al recupero dopo 24 ore ma senza aumento della glicolisi anaerobia:le ARPE-19 tendono a mantenere un metabolismo di tipo ossidativo,con uno shift verso altri substrati

Diabetic retinopathy is a common microvascular complication of diabetes. IGF-1 is a potent proangiogenic factor acting in the retina and therefore is considered to be of interest in degenerative diseases of this tissue. In this thesis i studied the effect of IGF1 on PKM2at 2, 4 and 24 hours, in an ex-vivo model of human pigmented epithelium, used as a model of diabetic retinopathy and therefore cultured in high glucose (20 Mm). The activity of PK and LDH was assayed by spectrophotometry. The results show that in high glucose, treatment of ARPE-19 cells with IGF-1 inhibits PK, increasing its nuclear localization, and decreasing oxidative metabolism, as early as 4 hours. This decrease remains persistent at 24 hours, both in ATP synthesis and oxygen consumption. The significant decrease in PK activity, indicates that ARPE-19 expresses PKM2, in high glucose. The activity of LDH, is similarly inhibited completely the efficiency of glycolysis is decreased. Oxidative phosphorylation, also in the presence of 3 inhibitors of the main metabolic substrates, (BPTES, glutaminase inhibitor, Etomoxir carnitine acyltransferase inhibitor, UK5099 pyruvate dehydrogenase inhibitor) was evaluated. Oxidative metabolism decreases but this is not offset by a corresponding increase in anaerobic metabolism; in fact, lactate production does not increase significantly and neither does glucose consumption. ATP content decreases, and the overall energy charge is altered, due to the relative increase in AMP, which remains stable at 24h. It can be concluded that ARPE-19 cells in elevated glucose undergo an overall decrease in oxidative phosphorylation efficiency, energy charge, with little tendency to recover after 24 h but no increase in anaerobic glycolysis: ARPE-19 cells tend to maintain an oxidative type of metabolism, with a shift to other metabolic substrates.