Modulazione di canali intracellulari di tipo TPC mediata da flavonoidi e molecole organiche di interesse farmacologico

Abstract

I canali TPC sono una famiglia emergente di proteine di membrana intracellulari fondamentali per la fisiologia cellulare sia di piante che di animali. In questo lavoro abbiamo studiato due canali omologhi di tale famiglia ovvero AtTPC1, localizzato sulla membrana vacuolare e unico membro dei TPC presente nella pianta modello Arabidopsis thaliana, e hTPC2 che si trova sulla membrana dei lisosomi ed è uno dei due membri dei TPC presenti nell’uomo, l’altro, hTPC1, è localizzato su endosomi. Applicando la tecnica del patch-clamp a vacuoli isolati da cellule del mesofillo fogliare di Arabidopsis, abbiamo verificato che AtTPC1 è un canale voltaggio dipendente attivato da calcio intracellulare. Abbiamo individuato diversi inibitori dell’attività del canale: il flavonoide naringenina (Nar), una molecola di nuova sintesi con struttura simile a Nar (M1) e l’alcaloide tetrandrina conosciuto come inibitore specifico di hTPC2. Per quanto riguarda hTPC2, è stata fusa al suo C-terminale la molecola fluorescente EGFP e abbiamo utilizzato il vacuolo vegetale come sistema eterologo di espressione. In vacuoli fluorescenti la presenza di concentrazioni nanomolari citosoliche del fosfoinositide PI(3,5)P2 evoca correnti significative, dimostrando come hTPC2 sia funzionalmente attivo. Naringenina si comporta da inibitore reversibile del canale. Per identificare il sito di binding di Nar, introduciamo nella struttrura di hTPC2, mediante biologia molecolare, tre mutazioni sito specifiche suggerite da calcoli di docking. Tuttavia il canale mutato, espresso in vacuoli AtTPC1-KO, risulta sempre inibito da Nar, indicazione che il sito di binding identificato non è quello corretto. L’espressione eterologa di hTPC2 ci ha consentito di valutare gli effetti inibitori di M1, l’azione voltaggio-dipendente del magnesio e del calcio citosolico sulle correnti mediate da hTPC2 e confermato che il canale è selettivo per lo ione sodio con una permeabilità trascurabile per lo ione potassio.

TPC channels are an emerging family of intracellular membrane proteins critical to the cell physiology of both plants and animals. In this work we studied two homologous channels of this family, namely AtTPC1, located on the vacuolar membrane and the only member of the TPC present in the model plant Arabidopsis thaliana, and hTPC2 which is localized on the membrane of the lysosomes and is one of the two members of the TPC present in humans, the other, hTPC1, is localized on endosomes. By applying the patch-clamp technique to vacuoles isolated from Arabidopsis leaf mesophyll cells, we verified that AtTPC1 is a voltage-dependent calcium-activated channel. We identified several inhibitors of channel activity: the flavonoid naringenin (Nar), a newly synthesized molecule with structure similar to Nar (M1) and the alkaloid tetrandrine known as a specific inhibitor of hTPC2. Regarding hTPC2, the fluorescent molecule EGFP was fused at its C-terminus and we used the plant vacuole as a heterologous expression system. In fluorescent vacuoles the presence of cytosolic nanomolar concentrations of the phosphoinositide PI(3,5)P2 evokes significant currents, demonstrating hTPC2 to be functionally active. Naringenin acts as a reversible channel inhibitor. To define the Nar binding site, we introduce into the structure of hTPC2, by molecular biology, three site-specific mutations suggested by docking calculations. However, the mutated channel, expressed in AtTPC1-KO vacuoles, is always inhibited by Nar, indicating that the identified binding site is not the correct one. The heterologous expression of hTPC2 allowed us to evaluate the effects of M1, the voltage-dependent action of magnesium and cytosolic calcium on hTPC2-mediated currents and confirmed that the channel is selective for the sodium ion with negligible permeability for the potassium ion.