Risposte immunitarie in Mytilus galloprovincialis a batteri marini potenzialmente patogeni (gen. Arcobacter)

Abstract

In questa tesi, attraverso esperimenti in vitro e in vivo, sono state studiate le interazioni di Arcobacter R1 e R2 con il sistema immunitario di M. galloprovincialis valutando una serie di parametri immunologici. Gli esperimenti in vitro sono stati svolti utilizzando emociti isolati o l’intero campione di emolinfa, estratti da molluschi adulti e incubati con concentrazioni differenti di Arcobacter R1 per brevi periodi di tempo, da 30 minuti a 60 minuti. Inoltre, sono stati studiati due differenti mezzi di esposizione (ASW ed HS). Sono stati indagati diversi parametri immunitari: la stabilità delle membrane lisosomiali, l’attività del lisozima e la produzione extracellulare di ROS. Il test delle membrane lisosomiali ha mostrato una destabilizzazione dose-dipendente delle membrane lisosomiali. Sono stati inoltre registrati un aumento significativo, da parte degli emociti, di produzione extracellulare di ROS e una piccola attività lisosomiale solo in siero. Trascorsi 90 minuti, sono stati osservati l’internalizzazione di Arcobacter negli emociti e la sua degradazione. Per gli esperimenti in vivo, i mitili adulti sono stati iniettati con una sospensione di Arcobacter R1 o R2 usando una siringa direttamente nel muscolo adduttore posteriore. Questi esperimenti hanno permesso di studiare le interazioni con i due ceppi di Arcobacter a livello di tutto il corpo di Mytilus. Dopo 24h dall’iniezione, gli stessi parametri immunitari degli esperimenti in vitro sono stati valutati nell’emolinfa. I risultati ottenuti hanno dimostrato che per entrambi i ceppi di Arcobacter, 24h sono sufficienti per attivare i parametri immunitari. In generale, le risposte di Arcobacter R1 e R2 sono risultate simili, causando una forte diminuzione di LMS, un significante aumento di produzione extracellulare di ROS e dell’attività lisosomiale. Questi primi dati sembrano indicare Arcobacter non come un batterio patogeno per i mitili ma bensì come specie opportunista.

In the present thesis, Arcobacter R1 and R2 were investigated for their interactions with the immune system of M. galloprovincialis considering immune parameters, after in vitro and in vivo exposure in laboratory. In vitro experiments were performed using the isolated hemocytes or the whole hemolymph sample, extracted from adult mussels, and incubated with different concentrations of Arcobacter R1 for short periods from 30min to 60min. Moreover, the role of the media (artificial sea water and hemolymph serum) was also studied. Several functional immune parameters were investigated: lysosomal membrane stability, lysozyme activity and extracellular ROS production. The LMS assay showed a dose-dependent destabilization of lysosome membranes. This was accompanied by a significant increase in extracellular ROS production by hemocytes and a small of induction lysozyme activity only in serum. Moreover, the internalization of Arcobacter inside the hemocytes was observed together with their degradation after 90min. For in vivo challenge, adult mussels were injected with a suspension of Arcobacter R1 or R2 using a syringe directly introduced into the posterior adductor muscle. In vivo experiments allowed to study the interactions with the two Arcobacter strains at the whole body level of Mytilus. After 24h post injection, the same immune functional parameters of in vitro experiments were evaluated in hemolymph. The results showed that 24h was sufficient time to activate immune functional parameters by both Arcobacter strains. Overall, the responses to both strains were similar, causing a strong decrease of the LMS, a significant increase in extracellular ROS production, and a meaningful increase of the lysozyme activity. The results so far obtained suggest that mussels are able to mount an efficient immune response against Arcobacter. These first data indicate that Arcobacter is not pathogenic to mussel but it may represent an opportunistic species.