L’attivazione di specifiche subunità di integrine mediata CRISPRa promuove il differenziamento neuronale delle cellule N2a.

Abstract

Lo sviluppo del sistema nervoso include una serie di processi cellulari, quali differenziamento, migrazione, crescita di assoni e neuriti, generazione di sinapsi e remodeling. Poiché alterazioni dei pathway responsabili del differenziamento neuronale possono portare a malattie neurologiche, è essenziale chiarire i meccanismi molecolari implicati in questi processi. Una conoscenza più approfondita dei modulatori del differenziamento neuronale può portare allo sviluppo di modelli in vitro più gestibili ed affidabili, che riproducano il microambiente tissutale e le interazioni cellulari caratterizzanti specifiche malattie neurologiche umane. Le integrine sono molecole d’adesione eterodimeriche, modulatrici di commitment cellulare, axon guidance e proliferazione; sono quindi fondamentali nella formazione e mantenimento di circuiti neuronali nel sistema nervoso centrale durante lo sviluppo e nell’adulto. È pur scarsamente noto come diverse subunità recettoriali si assemblino in momenti diversi del differenziamento fino a specificare popolazioni di neuroni post-mitotici. Ho qui usato il sistema CRISPR activation (CRISPRa) per aumentare l’espressione delle integrine αV e/o β3 nella linea cellulare murina di neuroblastoma N2a, usata come modello di differenziamento neuronale. Tramite analisi morfologica ho riscontrato come queste due integrine svolgono ruoli diversi nel differenziamento delle cellule N2a: l’aumento dell’espressione dell’integrina β3 induce fortemente lo sviluppo di neuriti in cellule mantenute in condizioni proliferative di coltura, mentre l’aumento di αV ha maggiore effetto sulla stabilizzazione dei neuriti e sulle ramificazioni in cellule differenziate tramite rimozione del siero dal terreno di coltura. Le mie osservazioni indicano che un controllo tempo-specifico e mediato da CRISPRa della modulazione dell’espressione di specifiche subunità di integrine potrebbe fornire un mezzo per il miglioramento di modelli in vitro di differenziamento neuronale.

The development of the nervous system involves a succession of cellular processes including differentiation, migration, axon and neurite outgrowth, and synapse formation and remodeling. Since dysregulations of pathways controlling neuronal differentiation can lead to the development of neurological disorders, it is important to elucidate the molecular mechanisms involved in these processes. Indeed, a deeper understanding of the neuronal differentiation regulators involved can lead to the development of manageable and reliable in vitro models able to capture the tissue microenvironment and cellular interactions, and finally recapitulate a human neurological disease. Integrins are heterodimeric cell adhesion molecules, enriched in the nervous system and well known modulator of cell commitment, axon pathfinding and proliferation; thus playing an essential role in the formation and maintenance of functional neuronal circuits, in the developing and adult Central Nervous System (CNS). However, little is known regarding how different receptor subunits are assembled at different maturation steps toward the final specific population of post-mitotic neurons. Here, I took advantage of the CRISPR activation (CRISPRa) system to enhance the expression of αV and/or β3 integrins in a model of neuronal differentiation, the murine N2a neuroblastoma cell line. Performing a morphological analysis, I found that these two integrin subunits play different roles in N2a cells differentiation: while increasing β3 integrin expression strongly triggers neurite outgrowth when cells are maintained in proliferative conditions, enhancing αV integrin expression has a greater effect on neurite stabilization and branching when cells are differentiated by serum deprivation. Taken together, my findings suggest that a timely controlled modulation of the expression of specific integrin subunits by CRISPRa could provide a mean to improve the development of in vitro models of neuronal differentiation.