Hcast 3-25: effetti dell'overespressione della nuova calpastatina non inibitoria sul sistema proteolitico calcio dipendente.

Abstract

Lo scopo dello studio è quello di indagare gli effetti dell’over-espressione della nuova calpastatina, hcast 3-25, cosiddetta “anomala”, sul sistema proteolitico Ca2+ - dipendente. Questa nuova forma di calpastatina inizia all'interno del dominio L (esoni 2 e 3) e continua con gli esoni da 25 a 29 che codificano per la coda C-terminale condivisa da tutte le calpastatine a lunghezza intera. È stato osservato che a differenza delle calpastatine, che sono prevalentemente varianti di splicing esenti dell’esone 3, hcast 3-25 è dotato dell'esone 3. Il razionale che giustifica la nostra indagine è: 1) hcast 3-25 manca degli esoni che codificano per i domini di inibizione della calpaina. 2) attualmente, non esistono anticorpi per questa specifica forma di calpastatina; 3) cambiamenti nell'espressione di hcast 3-25 potrebbero essere coinvolti in importanti processi cellulari fisiologici e patologici. Per studiare gli effetti sul sistema proteolitico Ca2+ -dipendente di hcast 3-25: 1) abbiamo clonato hcast 3-25 da un vettore di espressione procariotico a un vettore di espressione eucariotico (pEF1 / V5-His B). Esso contiene l'epitopo V5 all’estremità C-terminale, abbiamo riconosciuto hcast 3-25 trasfettandola e overesprimendola in cellule embionali umane di rene (HEK 293T); 2) sono stati condotti esperimenti su cellule eucariotiche per studiare gli effetti dell’over-espressione di hcast 3-25 sulla digestione delle proteine substrato della calpaina. Hcast 3-25 può essere considerato come un nuovo membro e possibile modulatore del sistema calpaina/calpastatina agendo come meccanismi alternativi all'inibizione.

The aim of the study is to investigate the effects of the over-expression of the new calpastatin, hcast 3-25, so-called “anomalous”, on the Ca2+ - dependent proteolytic system. The open reading frame of this new form of calpastatin starts inside the L-domain (exons 2 and 3) and continues with the exons from 25 to 29 that code for the C-terminal tail shared by all the full-length calpastatins. It was observed that unlike the other calpastatins, that are predominantly Δ3 splice variants, hcast 3-25 is endowed with exon 3. The rationale that justifies our investigation is: 1) hcast 3-25 lacks the exons that code for the for calpain inhibitory domains; 2) currently, there aren’t specific antibodies for this calpastatin form 3) changes in the expression of hcast 3-25 could be involved in important physiological and pathological cellular processes. To study the effects on the Ca2+ -dependent proteolytic system of hcast 3-25: 1) we transferred hcast 3-25 from a prokaryotic to a eukaryotic expression vector (pEF1 / V5-His B). Since it contains the epitope V5 at the C-terminal end, we have been able to recognize hcast 3-25 following transfection/over-expression of HEK 293 T; 2) experiments were performed on eukaryotic cells to study the effects of over-expression of hcast 3-25 on the digestion of calpain substrate proteins. This hcast 3-25 can be considered as a new member and possible modulator of the calpain/calpastatin system acting by a mechanisms alternative to inhibition.