Amplificazione plasmonica della fluorescenza di GEVI basati sull'Archaerodopsina per imaging di tensione

Abstract

Gli Indicatori di Voltaggio Geneticamente Codificati (GEVI) sono potenti strumenti optogenetici che rendono possibile la misura completamente ottica del potenziale di membrana nei neuroni. La visualizzazione della localizzazione subcellulare di queste proteine fluorescenti è però limitata dalla diffrazione della luce. Per via di questo stretto limite, la modellizzazione accurata dei segnali elettrici nelle spine dendritiche e strutture subcellulari è ancora oggetto di discussione. L'amplificazione plasmonica con nanoparticelle d'oro è una nuova soluzione promettente per ottenere selettivamente i segnali ottici riportanti la trasmissione sinaptica. L'accoppiamento tra nanoparticelle d'oro e proteine fluorescenti può portare ad una maggiore efficienza quantica (locale) e di conseguenza a punti diffraction-limited più luminosi. In questa tesi è stato seguito un approccio completo, dalle simulazioni all'applicazione biologica. Nanorod d'oro prodotti con litografia elettronica e nanostelle colloidali sono stati entrambi caratterizzati e testati su cellule HEK che esprimono i GEVI basati sull'Archaerodopsina. I risultati discussi evidenziano la sintonizzabilità e la stabilità di tali nanoparticelle, e al tempo stesso le limitazioni pratiche da affrontare negli esperimenti futuri, motivando la successiva ricerca sull'argomento.

Genetically Encoded Voltage Indicators (GEVIs) are powerful optogenetic tools that enable the all-optical measurement of membrane potential in neurons. However, visualizing the subcellular localization of these fluorescent proteins is limited by the diffraction of light. Because of this strict limit, accurate modeling of the electrical signals in dendritic spines and subcellular structures is still a subject of debate. Plasmonic enhancement using gold nanoparticles is a promising novel solution to selectively obtain optical signals reporting synaptic transmission. The coupling between gold nanoparticles and fluorescent proteins can lead to locally higher quantum yields and consequently to brighter diffraction-limited spots. In this thesis a complete approach from simulations to biological application has been taken. Gold nanorods produced by electron beam lithography and colloidally grown gold nanostars have both been characterized and tested on HEK cells expressing the Archaerhodopsin-based GEVIs. The results discussed highlight the tunability and the stability of such nanoparticles, as well as the practical limitations to overcome in future experiments, motivating further research on the subject.