Caratterizzazione funzionale di una variante al 5’UTR del gene LMX1B associata ad un caso familiare di Sindrome Unghia-Rotula.

Abstract

La sindrome Unghia-Rotula è una rara condizione autosomica dominante caratterizzata da displasia delle unghie, rotula assente o ipoplastica, presenza di corni iliaci e deformità del gomito e, meno frequentemente, glaucoma e nefropatia. Mutazioni o delezioni parziali/complete del gene LMX1B sono responsabili dell’insorgenza della sindrome e il principale meccanismo patogenetico alla base della malattia è l’aploinsufficienza. LMX1B codifica per un fattore di trascrizione appartenente alla famiglia LIM-omeodominio molto importante nello sviluppo embrionale. Due pazienti non correlati con ricorrenza di NPS sono risultati negativi per mutazioni nella regione codificante, così come per delezioni parziali o totali del gene LMX1B. Lo screening del 5'UTR del gene ha rilevato la presenza di due nuove varianti in eterozigosi, c.-174C>T e c.-226G>A. Le sequenze 5’UTR giocano un ruolo importante nella regolazione dell’espressione genica, per questo motivo abbiamo avviato uno studio funzionale volto a definire il potenziale ruolo patogenetico delle due sostituzioni identificate basato su: l’analisi in silico del 5’UTR, sulla verifica dell’espressione allele-specifica in cellule derivate dal paziente, per la variante -174C>T, e sull’analisi di espressione in sistemi eterologhi. Le due varianti inseriscono nel 5’UTR di LMX1B un nuovo ORF parzialmente sovrapponibile a quello principale, ma con cornice di lettura alterata. L’analisi in silico suggerisce che questo possa essere riconosciuto dal macchinario traduzionale cellulare; inoltre, la presenza della variante -174 altera potenzialmente dei siti di legame per fattori trascrizionali. I saggi funzionali applicati, suggeriscono che le varianti identificate possono contribuire, con meccanismi diversi, a influenzare l’espressione del gene. Ulteriori studi saranno necessari per confermare il ruolo di queste varianti e chiarire i meccanismi molecolari implicati.

Nail-Rotula syndrome is a rare autosomal dominant condition characterized by nail dysplasia, absent or hypoplastic patella, presence of iliac horns and elbow deformities, and, less frequently, glaucoma and nephropathy. Mutations or partial/complete deletions of the LMX1B gene are responsible for the onset of the syndrome, and the main pathogenetic mechanism underlying the disease is haploinsufficiency. LMX1B encodes for a transcription factor belonging to the LIM-homeodomain family that is very important in embryonic development. Two unrelated patients with recurrence of NPS were negative for mutations in the coding region, as well as for partial or total deletions of the LMX1B gene. Screening of the 5'UTR of the gene revealed the presence of two novel variants in heterozygosity, c.-174C>T and c.-226G>A. The 5'UTR sequences play an important role in the regulation of gene expression, therefore we initiated a functional study aimed at defining the potential pathogenic role of the two identified substitutions based on: in silico analysis of the 5'UTR, verification of allele-specific expression in patient-derived cells, for the -174C>T variant, and expression analysis in heterologous systems. The two variants insert a novel ORF into the 5'UTR of LMX1B that is partially overlapping with the main ORF, with altered reading frame instead. In silico analysis suggests that this may be recognized by the cellular translational machinery; in addition, the presence of the -174 variant potentially alters binding sites for transcriptional factors. Functional assays applied, suggest that the identified variants may contribute, by different mechanisms, to affect gene expression. Further studies will be required to confirm the role of these variants and to clarify the molecular mechanisms involved.