Metodi non invasivi di rilevamento del DNA tumorale circolante a finalità prognostiche e predittive nel carcinoma mammario in stadio iniziale

Abstract

Nelle pazienti affette da carcinoma mammario (BC) sottoposte a chemioterapia neoadiuvante (NACT) vi è una necessità insoddisfatta di marcatori non invasivi di risposta alla terapia. L’analisi del DNA circolante libero (cfDNA) e del DNA circolante tumorale (ctDNA) ha mostrato serio potenziale nel fornire nei pazienti neoplastici informazioni utili riguardanti diagnosi precoce, ricorrenza e risposta alla terapia, ma nessuna metodica standardizzata concernente questi marcatori è ad oggi approvata nella pratica clinica. Questo lavoro riassume in sé due studi condotti con la finalità di (a) migliorare la valutazione della risposta del BC alla NACT, eseguita ad oggi mediante risonanza magnetica (MRI), attraverso la stima della frammentazione del cfDNA (DF) mediante elettroforesi automatizzata su dispositivo Agilent TapeStation 2200, un metodo ampiamente utilizzato, riproducibile e poco costoso, (b) studiare l’efficacia del tagged targeted deep sequencing (tTDS) in rapporto alla droplet digital PCR (ddPCR) nel predire la recidiva di pazienti affette da BC dopo la chirurgia preceduta dalla NACT, tramite la ricerca nel plasma di mutazioni precedentemente identificate sul DNA di biopsie eseguite prima dell’inizio della NACT mediante sequenziamento massivo parallelo. La DF è stata espressa mediante l’indice di frammentazione del cfDNA (DFI), corrispondente al rapporto fra la concentrazione dei frammenti corti di cfDNA e quella dei frammenti più lunghi. Il DFI valutato dopo il completamento della NACT ha ottenuto una specificità di 0.92 e una sensibilità di 0.61 per valori superiori a 0.90 nel predire l’assenza di risposta patologica completa alla NACT, mostrando una maggiore accuratezza rispetto alla MRI. Il tTDS è stato in grado di dimostrare la presenza in circolo di una mutazione significativa in tutti i casi di recidiva studiati (n=4), anticipando mediamente di sei mesi l’effettiva ricaduta clinica, mentre solo una paziente con recidiva è stata identificata tramite ddPCR.

In breast cancer (BC) patients undergoing neoadjuvant chemotherapy (NACT) there is an unmet need for noninvasive predictive biomarkers of response. The analysis of circulating free DNA (cfDNA) and circulating tumor DNA (ctDNA) has shown serious potential in providing useful information in neoplastic patients concerning early diagnosis, recurrence, and response to therapy, but no standardized procedure involving these markers is currently approved in clinical practice for these intents. This work is a summary of two studies conducted in order to (a) improve the evaluation of BC presurgical response to NACT, currently performed by magnetic resonance imaging (MRI), through the assessment of cfDNA fragmentation (DF) by automated electrophoresis on an Agilent TapeStation 2200 device, a widely used, reproducible, and inexpensive method, (b) study the performance of tagged targeted deep sequencing (tTDS) in comparison with droplet digital PCR (ddPCR) in predicting clinical relapse of BC patients after surgery preceded by NACT, by tracking mutations in plasma previously identified on pretreatment biopsies DNA by massive parallel sequencing (MPS). DF was expressed as cfDNA fragmentation index (DFI), namely the ratio of shorter to larger fragments concentrations in cfDNA. DFI assessed after NACT completion before surgery achieved a 0.92 specificity and a 0.61 sensitivity for values above 0.90 in predicting the absence of pathological complete response to NACT, showing higher accuracy compared to MRI in this task. tTDS could demonstrate the presence of one deleterious mutation in all relapsed cases studied (n=4), with an average lead time of six months before clinical relapse, showing potential as a noninvasive method for the early detection of minimal residual disease in BC patients. Conversely only one relapsed patient could be identified with ddPCR.