Attivazione di NLRP3-inflammasoma nei pazienti con Malattia Renale Cronica

Abstract

In questo studio sono stati analizzati NLRP3, IL-1β e l’espressione di geni implicati nella regolazione dell’omeostasi mitocondriale (PGC1α, MFN2, NRF2) nel muscolo scheletrico di pazienti affetti da IRC. In vitro sono stati valutati gli effetti dell’uremia sulla via di segnalazione di NLRP3 e sull’omeostasi mitocondriale nella linea di cellule C2C12. Le biopsie muscolari sono state ottenute dal muscolo retto dell’addome di 25 pazienti affetti da IRC (età 69±10 anni, 18M/7F, eGFR 8±1mL/min 1,73m2) e da 10 soggetti sani (età 68±11,7M/3F, eGFR 100±4mL/min 1,73m2). L’espressione delle proteine NLRP3 e IL-1β è stata valutata mediante immunoistochimica, l’mRNA (NLRP3, IL1β, PGC1α, MFN2, NRF2) attraverso rt-PCR. In vitro, cellule C2C12 sono state trattate, per 5-48 ore, con il 10% di siero ottenuto da pazienti uremici o da controlli sani. NLRP3, IL1β, PGC1α, MFN2, NRF2 sono stati studiati con rt-PCR, caspasi 1 con western blot e il danno mitocondriale con colorazione mediante JC1. Nel muscolo di pazienti con IRC sono sovra-espressi mRNA e proteina NLRP3. Aumenta anche mRNA di IL-1 beta, ma non la sua proteina. In vitro, il trattemento per 5 ore con siero uremico porta a sovra-espressione di mRNA sia di NLRP3 che IL-1 beta e della proteina caspasi 1. PGC1α è inibito, MFN2 è sovra-espresso, così come NRF2. Dati in vitro mostrano che, mediante trattamento con siero uremico, PGC1α, MFN2, NRF2 sono iper-attivati. Il siero uremico riduce il rapporto di fluorescenza rosso/verde indicando una diminuzione del potenziale di membrana mitocondriale. In questo studio si è dimostrato che l’inflammasoma NLRP3 è attivato nel muscolo scheletrico di pazienti allo stadio 5 di IRC. Nelle cellule muscolari in coltura l’uremia rappresenta un importante fattore scatenante il sistema immunitario che attiva l’inflammasoma attraverso TLR4. Il blocco NLRP3/IL-1β offre un nuovo metodo per preservare l’evoluzione dell’infiammazione nel muscolo di pazienti con IRC.

We analyzed NLRP3, IL1β and gene expression of proteins regulating mitochondria homeostasis (PGC1α, MFN2, NRF2) in skeletal muscle of patients with CKD. In addition, in in vitro studies, the uremic serum (US) effects on TLR4, NLRP3 and mitochondria were evaluated. Rectus abdominis muscle biopsies were collected from 25 CKD patients (age 69±10 yrs,18M/7F,eGFR 8±1mL/min 1,73m2) scheduled for PD catheter insertion and from 10 healthy subjects (age 68±11,7M/3F, eGFR 100±4mL/min 1,73m2) during elective surgery for abdominal wall hernias. Protein expression (NLRP3, IL1β) were evaluated by immunohistochemistry, mRNA (NLRP3, IL1β, PGC1α, MFN2, NRF2) by rt-PCR. In vitro, C2C12 myotubes were exposed to 10% normal serum or US for 5-48 hours. NLRP3, IL1β, PGC1α, MFN2, NRF2 were studied by rt-PCR, caspase1 by western blot and mitochondria damage by JC1 staining and its ratios of red-to-green fluorescence emissions were quantitated by fluorimeter analysis. In CKD muscle, both NLRP3 mRNA and its protein were overexpressed. IL1β mRNA was overexpressed, but not IL1β protein. In vitro, 5-hour US treatment upregulated both NLRP3 and IL1β mRNAs and caspase1 protein. PGC1α (a mitochondrial biogenesis regulator) was downregulated in CKD muscle, while MFN2 (involved in mitochondrial fusion and in the mitochondrial network maintenance) was overexpressed. NRF2 (a player in supporting the mitochondria structural and functional integrity) was also overexpressed in CKD. These effects were supported by in vitro data: at 5 hours, US upregulated PGC1α, MFN2 and NRF2. Also US reduced the red/green fluorescence ratio indicating a decrease in mitochondrial membrane potential. Here, we show that the NLRP3 inflammasome is activated in skeletal muscle of CKD5 patients. In cultured myotubes, uremia is a potent trigger which activates inflammasome through TLR4 engagement. NLRP3/IL-1β blockade offers a novel method for rescuing inflammation in muscle of patients with CKD.