Formazione di ossido nitrico in piastrine stimolate da lectine: il ruolo della proteina chinasi attivata da AMP

Abstract

L'obbiettivo di questa tesi è stato valutare l’effetto in vitro di due lectine, WGA e PHA, sulla fosforilazione/attivazione dell’enzima eNOS e sulla conseguente sintesi di NO andando poi ad indagare su quale fosse la via coinvolta in tale attivazione in piastrine umane. WGA e PHA hanno indotto aumento della fosforilazione del residuo ser1177 dell'enzima NOS endoteliale con effetto tempo e dose dipendente. PHA è apparso più attivo rispetto a WGA. Misurando la conversione di L-[3H]arginina in L-[3H]citrullina, abbiamo determinato che entrambe le lectine attivano eNOS, sottolineando una notevole efficacia raggiunta con 10 µg/mL di PHA. La stimolazione delle piastrine con WGA e PHA, sia dose che tempo dipendente, ha determinato la consequenziale formazione di NO, prodotto di eNOS. Due conseguenze della produzione di quest'ultimo messaggero chimico locale sono l'attivazione della guanilato ciclasi citosolica e la successiva formazione di cGMP. Per approfondire le conoscenze riguardo le chinasi specificatamente coinvolte abbiamo testato singolarmente l'effetto di inibitori: LY2949002, MK2206, composto C, L-NAME e STO-609. I primi due sono risultati inefficaci, quindi le chinasi PI3K e AKT sembrerebbero escluse dal meccanismo. L'inibitore di eNOS, L-NAME, STO-609 per CaMKK e composto C per AMPK hanno indotto inibizione dell'attività di eNOS, dei livelli di NO e cGMP. I dati riportati in questo lavoro di ricerca suggeriscono il forte coinvolgimento della via CaMKK/AMPKa nella fosforilazione/attivazione di eNOS indotta da WGA e PHA, assunto che CaMKK sia la principale chinasi coinvolta nell'attivazione di AMPK. In più, entrambe le lectine causano indirettamente la fosforilazione di AMPK su thr172 in modo dipendente dalla dose e dal tempo.

The objective of this research was to evaluate the effect of two lectins, WGA and PHA, on the phosphoridation/activation of the enzyme eNOS and the consequent synthesis of NO and then to investigate which was the pathway involved in this activation in human platelets in vitro. WGA and PHA induced increased phosphorylation of the endothelial NOS enzyme on ser1177 residue with time and dose dependent effect. PHA appeared more active than WGA. By measuring the conversion of L-[3H]arginine to L-[3H]citrulline, we determined that both lectins activate eNOS, underlining a remarkable efficacy obtained with 10 µg/mL of PHA. The stimulation of platelets with WGA and PHA, both dose and time-dependent, determined the consequential formation of NO, a product of eNOS. Two consequences of the production of NO are the activation of cytosolic guanylate cyclase and the later formation of cGMP. In order to deepen the knowledge about the specifically involved kinases we have individually tested the effect of inhibitors: LY2949002, MK2206, compound C, L-NAME and STO-609. The first two were ineffective, so the kinases PI3K and AKT would seem to be excluded from the molecular mechanism. The inhibitor of eNOS, L-NAME, STO-609 for CaMKK and compound C for AMPK induced inhibition of eNOS activity, NO and cGMP levels. The data reported in this research work suggest the strong involvement of CaMKK/AMPKa in the phosphoridation/activation of eNOS induced by WGA and PHA, assuming that CaMKK is the main kinase involved in the activation of AMPK. In addition, both lectins indirectly cause phosphorylation of AMPK on thr172 depending on dose and time.