Caratterizzazione della frammentazione dei burst di rete in reti corticali derivate da hiPSC nella sindrome di Dravet

Abstract

La sindrome di Dravet è una rara e grave epilessia genetica dell’infanzia. I neuroni ottenuti da cellule staminali riprogrammate dei pazienti e coltivati su matrici di microelettrodi formano reti che generano eventi sincronizzati detti burst di rete. Nelle reti di pazienti con sindrome di Dravet e altri disturbi del neurosviluppo, questi burst si spezzano spesso in sotto-eventi consecutivi, un fenomeno detto frammentazione dei burst. Questa tesi ha indagato se la frammentazione sia presente anche in reti corticali miste eccitatorie e inibitorie derivate da due pazienti con diversa gravità clinica, e quanto la sua misura dipenda dal metodo di rilevazione dei burst, un passaggio per cui non esiste uno standard condiviso. Le reti dei due pazienti e di due donatori sani sono state registrate per diverse settimane di sviluppo presso la Tampere University (Finlandia). Un’analisi della frammentazione è stata integrata nella pipeline del laboratorio e le registrazioni sono state analizzate con due rilevatori di burst, uno basato sugli intervalli tra spike e uno sulla frequenza di scarica della rete, validati da un’analisi spettrale indipendente del segnale grezzo. La rete del paziente più grave è risultata la meno attiva e con i burst più frammentati, soprattutto nelle prime fasi dello sviluppo, in linea con la gravità clinica. I due metodi concordavano sul numero medio di frammenti per burst nella maggior parte delle linee, ma rilevavano numeri diversi di burst e frammenti, soprattutto nelle reti dei pazienti. I frammenti coincidevano con momenti di sincronizzazione particolarmente intensa. Questi risultati estendono il fenotipo di frammentazione a un nuovo modello della sindrome e mostrano che il conteggio dei frammenti dipende dal metodo: confrontare la frammentazione tra studi, o usarla per testare farmaci, richiederà parametri adattati a ogni dataset e validati da un occhio esperto.

Dravet syndrome is a rare and severe genetic epilepsy of childhood. Neurons derived from patients’ reprogrammed stem cells and grown on multi-electrode arrays form networks that fire in synchronised events called network bursts. In networks from patients with Dravet syndrome and other neurodevelopmental disorders, these bursts often break up into consecutive sub-events, a pattern known as burst fragmentation. This thesis asked whether burst fragmentation is also present in networks of mixed excitatory and inhibitory cortical neurons derived from two Dravet syndrome patients with different clinical severity, and how its measurement depends on the burst-detection method, a step for which no agreed standard exists. Networks from the two patients and two healthy donors were recorded over several weeks of development at Tampere University (Finland). A fragmentation analysis was added to the laboratory’s pipeline, and all recordings were analysed with two burst detectors, one based on inter-spike intervals and one on the population firing rate, with an independent spectral analysis of the raw signal as validation. The network from the more severely affected patient was the least active and showed the most fragmented bursts, especially early in development, consistent with the clinical severity of the two patients. The two detectors agreed on the average number of fragments per burst in most cell lines, but identified different numbers of bursts and fragments, particularly in patient-derived networks. Fragments coincided with moments of especially strong synchronisation in the raw signal. These results extend the fragmentation phenotype to a new model of Dravet syndrome and show that fragment counts depend on the detection method: comparing fragmentation across studies, or using it as a readout for drug testing, will require detection settings tuned to each dataset and validated by expert inspection.