Valutazione strutturale e funzionale della componente astrocitaria in co-colture con cellule SH-SY5Y

Abstract

Il focus dell’attività è comprendere e quantificare come gli astrociti rimodellino la loro struttura e funzione se esposti a cellule tumorali (in particolare di neuroblastoma SH-SY5Y) in varie condizioni: contatto diretto o con mezzo condizionato. Lo scopo è quello di comprendere e caratterizzare le dinamiche della risposta funzionale e strutturale degli astrociti in seguito alla loro interazione con il microambiente tumorale, che induce reattività astrocitaria, come altri contesti di neuroinfiammazione. In particolare, sono state utilizzate colture in vitro in 2D di cellule di corteccia e ippocampo di ratto, inizialmente separate da una barretta di PDMS per permettere la formazione di reti cellulari indipendenti e poi fatte interagire tramite rimozione della barretta. Quando la rete era ormai matura, sempre con iniziale separazione tramite PDMS, sono state aggiunte le cellule tumorali da un solo lato. In seguito, tramite immunofluorescenza è stata effettuata la marcatura dei campioni con GFAP e S100β. Questi sono poi stati acquisiti tramite microscopio PRISM a super risoluzione e successivamente sottoposti ad analisi tramite il software Fiji. I risultati mostrano una minore attivazione del marcatore funzionale soprattutto nelle condizioni di contatto diretto rispetto ai mezzi condizionati, ma anche una riorganizzazione strutturale degli astrociti esposti all’ambiente tumorale. Nonostante gli effetti sulle cellule astrocitarie della neuroinfiammazione, anche di origine tumorale, siano ampiamente trattati in letteratura, si osserva una carenza di modelli in vitro complessi capaci di simulare più accuratamente le dinamiche di interazione tra le metastasi e le cellule cerebrali. In questo contesto, si inserisce il presente lavoro di tesi, che propone un modello in vitro controllato e compartimentato che ricrea un’interconnessione fisiologica tra la corteccia cerebrale e l’ippocampo. Questi sono circuiti normalmente implicati in molteplici processi patologici.

The focus of this study is to understand and quantify how astrocytes remodel their structure and function when exposed to tumor cells (specifically SH-SY5Y neuroblastoma cells) under various conditions: direct contact or exposure to conditioned medium. The aim is to characterize the dynamics of the functional and structural response of astrocytes following their interaction with the tumor microenvironment—which, like other contexts of neuroinflammation, induces astrocytic reactivity. Specifically, 2D in vitro cultures of rat cortical and hippocampal cells were used; initially, they were separated by a PDMS barrier to allow for the formation of independent cellular networks, and were subsequently brought into interaction by removing the barrier. Once the network had matured—again following initial separation via PDMS—tumor cells were added to one side only. Subsequently, samples were labeled for GFAP and S100β using immunofluorescence. Images were acquired using a PRISM super-resolution microscope and analyzed with Fiji software. The results show lower activation of the functional marker—particularly under direct contact conditions compared to conditioned medium—as well as structural reorganization of the astrocytes exposed to the tumor environment. Although the effects of neuroinflammation (including that of tumor origin) on astrocytes are widely documented in the literature, there is a lack of complex in vitro models capable of accurately simulating the interaction dynamics between metastases and brain cells. This thesis addresses this gap by proposing a controlled, compartmentalized in vitro model that recreates a physiological interconnection between the cerebral cortex and the hippocampus. These are circuits normally implicated in multiple pathological processes.