Effetti del silenziamento di TGDS su linee cellulari di melanoma e di colon-carcinoma

Abstract

Il gene TGDS, situato sul cromosoma 13, codifica per l’omonima proteina (TDP-glucose 4,6-dehydratase), un enzima appartenente alla superfamiglia delle deidrogenasi/reduttasi a catena corta (SDR), noti per il loro ruolo cruciale nel metabolismo cellulare. Mutazioni a carico di questo gene sono riconosciute come causa della sindrome di Catel-Manzke (CMS), una rara patologia genetica a trasmissione autosomica recessiva. Sebbene l’esatta funzione di TGDS nell’uomo non sia ancora del tutto definita, le manifestazioni cliniche della CMS, come le anomalie scheletriche e craniofacciali, suggeriscono un suo coinvolgimento significativo nella biosintesi dei proteoglicani. Per indagare il ruolo di TGDS, questo studio si è servito della tecnica di RNA interference (RNAi), un meccanismo che permette di silenziare in maniera specifica l’espressione genica. Studi preliminari condotti nel nostro laboratorio, che avevano utilizzato un silenziamento stabile mediante shRNA, avevano rivelato alcune differenze nell’espressione genica nelle cellule silenziate rispetto al controllo ottenuto utilizzando un shRNA “non-targeting”. Una prima parte di questo lavoro ha quindi avuto lo scopo di confermare queste differenze mediante RT-qPCR. Successivamente è stato anche valutato un approccio di silenziamento transiente di TGDS con siRNA. Questa scelta è motivata dalla volontà di evitare l’integrazione genomica dei vettori virali e i relativi effetti collaterali, come l’attivazione di meccanismi di risposta allo stress cellulare che erano stati precedentemente osservati.

The TGDS gene, located on chromosome 13, encodes the eponymous protein (TDP-glucose 4,6-dehydratase), an enzyme belonging to the short-chain dehydrogenase/reductase (SDR) superfamily, known for their crucial role in cellular metabolism. Mutations in this gene are recognized as the cause of Catel-Manzke syndrome (CMS), a rare genetic disorder with autosomal recessive inheritance. Although the exact function of TGDS in humans is not yet fully defined, the clinical manifestations of CMS, such as skeletal and craniofacial abnormalities, suggest its significant involvement in proteoglycan biosynthesis.

To investigate the role of TGDS, this study utilized the technique of RNA interference (RNAi), a mechanism that allows for the specific silencing of gene expression. Preliminary studies conducted in our laboratory, which had used stable silencing with shRNA, revealed some differences in gene expression in the silenced cells compared to the control obtained using a "non-targeting" shRNA. Therefore, a first part of this work aimed to confirm these differences using RT-qPCR. Subsequently, a transient silencing approach of TGDS with siRNA was also evaluated. This choice is motivated by the desire to avoid the genomic integration of viral vectors and their relative side effects, such as the activation of cellular stress response mechanisms that had been previously observed.