Caratterizzazione e valutazione dell’attività biologica di tre popolazioni di vescicole extracellulari derivate da globuli rossi

Abstract

Questo elaborato si pone l’obiettivo di confrontare tre popolazioni di vescicole extracellulari derivanti da globuli rossi, al fine di valutarne l’eventuale effetto biologico intrinseco. Tali vescicole extracellulari hanno infatti suscitato un crescente interesse nella comunità scientifica per le loro peculiari proprietà, in particolare in relazione alla potenziale applicazione nella veicolazione di farmaci. Tuttavia, la valutazione dei loro effetti biologici naturali è ancora poco esplorata. Le vescicole utilizzate in questo studio sono state ottenute da sacche di emazie leucodeplete, dalle quali sono state ricavate tre popolazioni mediante strategie di produzione diverse: gli EriEritrosomi (EryEs), rilasciati naturalmente dal globulo rosso, vengono isolati, mediante ultracentrifugazione, a partire dai surnatanti ottenuti da centrifugazioni consecutive del campione eritrocitario; i NanoEritrosomi (NanoEs) vengono prodotti artificialmente tramite la sonicazione delle emazie, ed, infine, il rilascio dei cosiddetti Erieritrosomi da vescicolazione indotta (VI-EryEs) viene stimolato incubando le cellule con calcio ionoforo. Le tre popolazioni sono state inizialmente caratterizzate misurando la loro concentrazione, dimensione ed espressione di marcatori vescicolari ed eritrocitari. Sono stati infine condotti esperimenti in vitro, stimolando una linea cellulare di fibroblasti con le tre popolazioni di vescicole, al fine di confermare i dati ottenuti da un’analisi proteomica precedentemente condotta nel laboratorio in cui ho svolto il tirocinio. Nello specifico, sono stati condotti: i) test di vitalità (MTT) volti ad escludere effetti citotossici o proliferativi delle vescicole, ii) saggi per la determinazione dei livelli di specie reattive dell’ossigeno (ROS), per la valutazione della loro eventuale attività antiossidante o pro-ossidante, iii) saggi di migrazione cellulare (wound healing), per indagare un possibile ruolo delle vescicole nella comunicazione cellulare.

This paper has the objective of comparing three red blood cell-derived extracellular vesicle populations, with the aim of evaluating their possible intrinsic biological effect. These vesicles have, in fact, sparked a growing interest in the scientific community for their peculiar features, especially in relation to their potential application in drug delivery. However, the evaluation of their natural biological effects is still little explored. The vesicles used in this study were obtained from sacks of leucodepleted red blood cells, from which three populations were acquired, using three different production strategies: EryErythrosomes (EryEs), released naturally by erythrocytes, are isolated, via ultracentrifugation, directly from the supernatants derived from sequential centrifugation of the red blood cell sample; NanoErythrosomes (NanoEs) are artificially created through sonication of the cells, and, finally, the release of Vesiculation-Induced EryErythrosomes (VI-EryEs) is stimulated by a calcium ionophore incubation. The three populations were initially characterized by measuring their concentration, dimension and expression of vesicular and erythrocyte markers. In vitro experiments were eventually performed, stimulating a fibroblast cell line with the three vesicle populations, so to confirm data obtained from a proteomic analysis previously carried out in the laboratory where I attended the internship. In particular, three kinds of experiment were performed: i) cell viability tests (MTT), to exclude vesicular cytotoxic or proliferative effects, ii) detection of reactive oxygen species (ROS) assays, to identify their possible antioxidant or pro-oxidant activity, iii) cellular migration assays (wound healing), to examine the potential role of vesicles in cellular communication.