Effetti del silenziamento di Tgds sul differenzimento condrogenico delle cellule ATDC5.

Abstract

La sindrome di Catel-Manzke è una malattia genetica rara a esordio neonatale o nei primi mesi di vita. A livello molecolare, la sindrome è principalmente causata da mutazioni nel gene TGDS, codificante l’enzima TDP-glucosio 4,6-deidratasi. Questo enzima, membro della famiglia delle deidrogenasi/reduttasi a catena corta (SDR), non ha ancora una funzione definita per l’Homo sapiens. Lo scopo di questa tesi è stato verificare il silenziamento di Tgds mediato da shRNA nella linea cellulare ATDC5 e valutare gli effetti sul suo differenziamento condrogenico. Oltre al shRNA target (shRNA49) è stato anche utilizzato come controllo negativo un shRNA con una sequenza definita “scramble” (non targeting). Dopo l'induzione del differenziamento, è stata comparata la produzione dei GAG nelle cellule silenziate rispetto al controllo mediante analisi colorimetriche. È stata inoltre valutata la deposizione di matrice ossea nelle fasi terminali del differenziamento. In parallelo, sono state condotte analisi mediante RT-qPCR sia su Tgds, sia su altri geni che partecipano in modo importante nelle varie tappe della condrogenesi, quali Sox9, Col2a1, Acan e Col10a1.

Catel-Manzke syndrome is a rare genetic disorder with onset in the neonatal period or during the first months of life. At the molecular level, the syndrome is primarily caused by mutations in the TGDS gene, which encodes the enzyme TDP-glucose 4,6-dehydratase. This enzyme, a member of the short-chain dehydrogenase/reductase (SDR) family, does not yet have a defined function in Homo sapiens. The aim of this thesis was to verify shRNA-mediated Tgds silencing in the ATDC5 cell line and to evaluate its effects on chondrogenic differentiation. In addition to the target shRNA (shRNA49), a negative control shRNA with a defined “scramble” sequence (non-targeting) was also used. After induction of differentiation, the production of GAGs in silenced cells was compared to the control using colorimetric assays. Furthermore, bone matrix deposition was assessed in the terminal stages of differentiation. In parallel, RT-qPCR analyses were conducted on Tgds as well as on other genes that play key roles in the various stages of chondrogenesis, such as Sox9, Col2a1, Acan, and Col10a1.