Ottimizzazione di una metodica per la valutazione dei ROS in leucociti di pazienti con Deficit di ADA2 tramite citofluorimetria

Abstract

Il presente lavoro ha come obiettivo l’ottimizzazione di una metodica citofluorimetrica, al fine di valutare la produzione di ROS da parte dei leucociti nei pazienti con malattie autoinfiammatorie e in particolare in soggetti affetti da Deficit di ADA2. Il deficit di ADA2 (DADA2) è una malattia autoinfiammatoria genetica descritta recentemente, causata da mutazioni in omozigosi nel gene ADA2. È caratterizzata da una grave vasculopatia e infarti cerebrali in età pediatrica. Recentemente è stato dimostrato come una disregolazione del processo di NETosi nei neutrofili sia implicata nell’ infiammazione esacerbata in questi pazienti. I ROS sono delle molecole chiave nel processo infiammatorio e nella NETosi ed è per questo che è nato l’interesse nel valutare la produzione dei ROS. I leucociti da sangue periferico di donatori sani sono stati utilizzati per mettere a punto il metodo, ottimizzare alcuni aspetti tecnici come la purezza del campione e attivazione cellulare e definire i range di normalità. I pazienti affetti da DADA2 sono stati valutati in seguito. Le analisi dei dati e i numeri hanno consentito di effettuare un’analisi statistica che ha evidenziato come la produzione dei ROS nei pazienti con DADA2 sia significativamente aumentata. Infine, è stata valutata la NETosi sui neutrofili purificati di donatori sani tramite il saggio in vitro dell’elastasi con l’obiettivo di mettere a punto il metodo e fare una prima valutazione dei pazienti DADA2.

In order to evaluate the production of ROS of leukocytes in patients with autoinflammatory diseases and in particular ADA2 Deficiency patients, the present work aims to optimize an in vitro method by flow-citometry. ADA2 deficiency (DADA2) is a recently described genetic autoinflammatory disease caused by homozygous mutations in the ADA2 gene. It is characterized by severe vasculopathy and cerebral strokes in childhood. It has recently been demonstrated that a dysregulation of the NETosis process in neutrophils is implicated in the exacerbated inflammation in these patients. Evaluation of ROS production is interesting because they are key molecules in the inflammatory and NETosis process. Leukocytes from peripheral blood of healthy donors were used to develop the method, optimize some technical aspects, such as sample purity and cell activation and to define normal ranges. Next, DADA2 patients were evaluated. Data analyses allowed us to highlight how the production of ROS of neutrophils isolated from DADA2 patients was significantly increased. Finally, to set up the method for NETosis evaluation on purified neutrophils, we used an in vitro elastase assay first in healthy donors and next to make a first evaluation in DADA2 patients.