Ottimizzazzione della valutazione dell'attivazione e del profilo citochinico di linfociti T antigene-specifici per valutare la risposta immune cellulo-mediata in citometria a flusso

Abstract

La citometria a flusso offre numerosi approcci numerosi per studiare le cellule T antigene-specifiche. In particolare, la valutazione di marcatori di attivazione indotti dall'antigene (AIM) e l’analisi intracitoplasmatica (ICS) delle citochine prodotte, permetono di stimare la frequenza dei linfociti T antigene-specifici e una loro caratterizzazione funzionale. Scopo della tesi è stato combinare i due approcci AIM e ICS per avere una visione più completa della risposta delle cellule T specifiche . Il protocollo combinato ha analizzato: il pannello degli anticorpi, la preparazione del campione, i tempi di incubazione in presenza di reagenti di blocco della secrezione (Brefeldina A, BFA) che permettono la misura delle citochine (IFNγ, TNFα e IL-2). Come antigene è stato utilizzato un megapool di peptidi della proteina Spike del virus SARS-Cov2 per attivare linfociti periferici di operatori sanitari sottoposti alla vaccinazione per tale virus. Per quanto riguarda il pannello, l'espressione di CD134 (OX40) e CD69 è stata testata insieme al CD137 intracellulare (ic) per rilevare le cellule T AIM+. Diverse tempistiche di incubazione con i peptidi sono state analizzate per definire la tempistica che garantisse il minore impatto sull’espressione dei marcatori AIM da parte di BFA. I risultati hanno mostrato che il marcatore CD134 contribuisce minimamente alla misura delle cellule T CD4+ e CD8+ AIM+, mentre determinante è risultato CD69 associato alla colorazione intracitoplasmatica di CD137 (ic-CD69 e ic-CD137). L'analisi delle citochine IFNγ, TNFα e IL-2 ha ulteriormente confermato la migliore performance della coppia CD137/CD69+ che risultava in frequenze più alte di linfociti in grado di produrre citochine rispetto alla coppia CD137/CD134. Tale protocollo è stato applicato per studiare le risposte verso SARS-CoV2, ma è potenzialmente applicabile a qualsiasi altro contesto che richieda indagini delle cellule T antigene-specifiche.

Flow cytometry provides many approaches to study antigen-specific T cells. The evaluation of antigen-induced activation markers (AIM) and intracytoplasmic analysis (ICS) of cytokines produced, allow estimation of the frequency of antigen-specific T lymphocytes and a functional characterization of them. The aim of the thesis was to combine the two approaches AIM and ICS to get a more comprehensive view of the response of specific T cells. The combined protocol analyzed: the antibody panel, sample preparation, incubation times in the presence of secretion blocking reagents (Brefeldin A, BFA) that allow the measurement of cytokines (IFNγ, TNFα and IL-2). A megapool of SARS-Cov2 virus Spike protein peptides was used as antigen to activate peripheral lymphocytes of health care workers undergoing vaccination for that virus. As for the panel, the expression of CD134 (OX40) and CD69 was tested together with intracellular CD137 (ic) to detect AIM+ T cells. Different incubation timings with the peptides were analyzed to define the timing that ensured the least impact on AIM marker expression by BFA. The results showed the marker CD134 contributes minimally to the measurement of CD4+ and CD8+ AIM+ T cells, while CD69 associated with intracytoplasmic staining of CD137 (ic-CD69 and ic-CD137) was determinant. Analysis of the cytokines IFNγ, TNFα and IL-2 further confirmed the better performance of the CD137/CD69+ pair, which resulted in higher frequencies of cytokine-producing lymphocytes than the CD137/CD134 pair. This protocol was applied to study responses toward SARS-CoV2, but is potentially applicable to any other context that requires investigation of antigen-specific T cells.