Nintedanib downregola il fenotipo pro-fibrotico M2 nei macrofagi di pazienti affetti da sclerosi sistemica con interstiziopatia polmonare

Abstract

BACKGROUND. La sclerosi sistemica (SSc) è una malattia immuno-mediata caratterizzata da fibrosi progressiva di cute e polmoni, e l’interstiziopatia polmonare (IP) è una complicanza che contribuisce sostanzialmente alla mortalità. I macrofagi sono coinvolti nel danno infiammatorio, e quelli con fenotipo M2 sembrano implicati nella patogenesi dei fenomeni profibrotici attraverso il rilascio di citochine e fattori di crescita. Il nintedanib è un inibitore tirosin-chinasico che agisce su diversi mediatori fibrotici ed è approvato per il trattamento dell’IP secondaria a SSc. Lo scopo dello studio era investigare l’effetto in vitro di nintedanib sui macrofagi di pazienti con SSc-IP. METODI. Dodici pazienti affetti da SSc-IP, classificati secondo i criteri ACR/EULAR del 2013, sono stati reclutati presso la Clinica Reumatologica dell’Università di Genova. I loro monociti, prelevati da sangue periferico, sono stati prima differenziati in macrofagi e poi mantenuti in terreno di coltura neutro o trattati con nintedanib (0,1 e 1μM) per 3, 16 e 48 ore. L'espressione genica e proteica di CD204, CD163, CD206, MerTK e IL10 è stata valutata tramite qRT-PCR e Western blot. La sintesi di TGF-β1 è stata valutata mediante ELISA. L'analisi statistica è stata effettuata mediante i test non-parametrici di Wilcoxon e Mann-Whitney. RISULTATI. Nei macrofagi di pazienti con SSc-IP, il nintedanib ha significativamente ridotto l'espressione genica di CD204, CD206, CD163 e MerTK a 24 ore dal trattamento e MerTK e IL-10 a 16 ore, rispetto alle cellule non trattate. Nintedanib ha inoltre significativamente ridotto la sintesi proteica di CD204, CD206, CD163, MerTK e TGF-β1 dopo 24 ore di trattamento. CONCLUSIONI. Il nintedanib sembra ridurre i marcatori del fenotipo M2 e l'attività profibrotica dei macrofagi di pazienti con SSc-IP, attraverso la riduzione dell'espressione genica e della sintesi proteica di CD204, CD206, CD163, MerTK, TGF-β1 e IL10.

BACKGROUND. Systemic sclerosis (SSc) is a rheumatic disease marked by progressive fibrosis of skin and lungs, and interstitial lung disease (ILD) contributes significantly to mortality. Macrophages are involved in the inflammatory damage, and alternatively activated (M2) macrophages seem to have a profibrotic role through the release of profibrotic molecules. Nintedanib is a tyrosine kinase inhibitor targeting several fibrotic mediators and is approved for treatment of SSc-related ILD. This study aimed to investigate nintedanib’s potential to downregulate the profibrotic M2 phenotype in monocyte-derived macrophages (MDMs) from SSc-ILD patients. METHODS. Twelve SSc-ILD patients meeting 2013 ACR/EULAR criteria were recruited at the Rheumatology Clinic of the University of Genova. Peripheral blood monocytes were isolated, differentiated into MDMs, and then either left untreated or treated with nintedanib (0.1 and 1μM) for 3, 16, and 24 hours. Gene and protein expression of macrophage scavenger receptors (CD204, CD163), mannose receptor-1 (CD206), MerTK and interleukin-10 (IL-10) were evaluated by quantitative real-time polymerase chain reaction and Western blotting. Transforming growth factor-β1 (TGF-β1) level was evaluated in the supernatant by ELISA. Statistical analysis employed non-parametric tests. RESULTS. In SSc-ILD MDMs, nintedanib 0.1 and 1μM downregulated gene expression and protein synthesis of CD204, CD206, CD163 and MerTK after 24 hours of treatment. The gene expression of MerTK and IL-10 was also downregulated after 16 hours of treatment compared to untreated cells. In SSc-ILD MDMs, nintedanib 0.1 and 1μM significantly reduced the production and release of TGF-β1 after 24 hours of treatment. CONCLUSIONS. Nintedanib downregulates the M2 phenotype and the profibrotic activity of MDMs obtained from SSc-ILD patients, through the reduction of the gene expression and protein synthesis of CD204, CD206, CD163, MerTK, as well as the reduction of TGFβ1 release.