Analisi funzionale delle varianti genetiche del gene CLCN4 per la valutazione della loro potenziale patogenicità

Abstract

Mutazioni del gene CLCN4 sul cromosoma X causano fenotipi neurologici in pazienti umani. Tale gene esprime un trasportatore a livello delle membrane endosomiali: ClC-4, con comportamento di antiporto 2Cl^-/ H^+. Studiarne le mutazioni e confrontarne la funzionalità a livello elettrofisiologico potrebbe permettere di svelare il suo ruolo, ancora non chiarito, in condizioni fisiologiche e patologiche. Nel presente lavoro si è studiata in particolare la mutazione Y177N, identificata in un paziente umano affetto da gravi ritardi nello sviluppo motorio e delle comunicazioni. Si tratta di una variante de novo, non nota precedentemente. La mutazione è stata riprodotta in vitro e la funzionalità del trasportatore corrispondente è stata analizzata tramite la tecnica del voltage-clamp a due elettrodi, dopo averla fatta esprimere in oociti di Xenopus laevis. Il canale mutato è stato inoltre espresso in cellule umane HeLa e ne è stata studiata l’interazione con la proteina inibitrice di ClC-4, TMEM9B. Y177N presenta un effetto gain of function per quanto riguarda l’interazione di ClC-4 con TMEM9B. Questo risultato va ad ampliare la conoscenza riguardante il trasportatore ClC-4 e le patologie associate al gene CLCN4, unendosi al continuo lavoro dei ricercatori che collaborano con l’associazione Cure CLCN-4.

Mutations of the human X-linked gene CLCN4 cause neurological phenotypes in human patients. CLCN4 encodes the membrane transporter protein in endosomes, ClC-4, which functions as a 2Cl^- / H^+ antiporter. Studying its mutations and comparing its functionality via electrophysiological assays could help understand its role, still not fully clear, in physiological as well as pathological scenarios. In this work the variant Y177N, identified in a patient who shows severe delays in motor and communication development, has been studied. Y177N is so far an undescribed de novo variant. The mutation has been reproduced in vitro and the functionality of the corresponding antiporter has been analyzed by two-electrode voltage-clamp after exogenous expression in Xenopus laevis oocytes. The mutated protein has also been expressed in HeLa human cells, where its interaction with TMEM9B, an inhibiting protein of ClC-4, has been studied. This resulted in the classification of Y177N as a gain of function variant, contributing to the knowledge regarding ClC-4 and CLCN4-related diseases, and joining the continuous work of researchers who collaborate with the association Cure CLCN-4.