Diagnosi differenziale delle nodopatie autoimmuni: sviluppo e validazione di metodi per la rilevazione di autoanticorpi anti- proteine nodali e paranodali

Abstract

Nell'ultimo decennio, all’interno dello spettro delle polineuropatie infiammatorie demielinizzanti croniche (CIDP), è stato identificato un sottogruppo di pazienti caratterizzato dalla presenza di autoanticorpi IgG diretti contro proteine localizzate a livello del nodo di Ranvier e della regione paranodale, in particolare NF-155, CNTN-1 e CASPR1. Tali condizioni, attualmente classificate come nodopatie autoimmuni, presentano un fenotipo clinico distinto e una risposta limitata alle terapie convenzionali (IVIg e corticosteroidi). Ad oggi, tuttavia, non sono disponibili kit diagnostici commerciali certificati. La determinazione anticorpale è quindi affidata a metodiche in-house non standardizzate eseguite da pochi laboratori specializzati, e le linee guida EAN/PNS 2021 raccomandano la conferma di ogni positività mediante una seconda metodica. Il presente lavoro di tesi si è proposto di implementare e confrontare tre metodiche basate su principi analitici differenti: un ELISA in-house su proteine ricombinanti, un CBA commerciale a solo scopo di ricerca e un TBA in immunofluorescenza su fibre dissociate di nervo sciatico di ratto. Le metodiche sono state applicate a 37 sieri comprendenti campioni di siero noto, pazienti con sospetta nodopatia, controlli MAG e GBS positivi e donatori sani. È stata inoltre valutata l'introduzione di un sistema di amplificazione del segnale avidina-biotina nei protocolli in immunofluorescenza. I risultati hanno evidenziato concordanza completa tra le metodiche sui sieri noti e negatività in tutti i controlli, unitamente a discordanze tra ELISA e CBA nei campioni dei pazienti, riconducibili alle differenti modalità di presentazione dell'antigene. L'amplificazione del segnale ha consentito di rilevare reattività non evidenziabili con i protocolli convenzionali. La limitata numerosità campionaria non permette, ad oggi, di definire un protocollo standardizzato di screening e conferma.

Over the last decade, within the spectrum of chronic inflammatory demyelinating polyneuropathies (CIDP), a subgroup of patients has been identified characterized by the presence of IgG autoantibodies directed against proteins located at the node of Ranvier and in the paranodal region, in particular Neurofascin-155, Contactin-1 and CASPR1. These conditions, currently classified as autoimmune nodopathies, display a distinct clinical phenotype and a limited response to conventional therapies (IVIg and corticosteroids). Their early identification is therefore of clinical and therapeutic relevance. To date, however, no certified commercial diagnostic kits are available. Antibody testing therefore relies on non-standardized in-house methods performed by a few specialized laboratories, and the 2021 EAN/PNS guidelines recommend confirmation of any positive result by a second method. Within this context, the present thesis aimed to implement and compare three methods based on different analytical principles: an in-house ELISA on recombinant proteins, a commercial research-use-only CBA and an immunofluorescence TBA on teased rat sciatic nerve fibres. The methods were applied to 37 sera, comprising reference samples with known antibody profile, patients with suspected nodopathy, anti-MAG and GBS-positive disease controls and healthy donors. The introduction of an avidin-biotin signal amplification system into the immunofluorescence protocols was also evaluated. The results showed complete concordance between the methods on the reference sera and negativity in all controls, together with discrepancies between ELISA and CBA in patient samples, attributable to the different modes of antigen presentation. Signal amplification enabled the detection of reactivities not detectable with conventional protocols. The limited sample size does not currently allow a standardized screening and confirmation protocol to be defined;