Preparazione di campioni tissutali per lo studio delle popolazioni linfocitarie in citometria a flusso

Abstract

L’immunoterapia oncologica manipola il sistema immunitario del paziente a riconoscere ed eliminare le cellule tumorali, offrendo nuove possibilità di cura e controllo della malattia. È noto da tempo che i tumori riescono a “spegnere” i linfociti T effettori, attraverso segnali di freno immunologico, noti come checkpoint immunitari, e grazie alla presenza di circuiti immunosoppressivi generati dalla presenza nell’infiltrato tumorale di linfocitari T regolatori e di cellule mieloidi soppressive. La citometria multiparametrica rappresenta la piattaforma tecnologica più utilizzata per studiare in modo più dettagliato la componente linfocitaria T presente nell’ecosistema tumorale. Per garantire la correttezza e solidità dei risultati ottenuti con la citometria a flusso è fondamentale l’ottimizzazione dei protocolli di riduzione delle biopsie alla sospensione cellulare che costituisce la fase pre-analitica del protocollo di immunofenotipo delle popolazioni linfocitarie. Il progetto svolto durante la mia tesi ha analizzato l’impatto sull’analisi citometrica di diversi protocolli di conservazione e dissociazione enzimatica e meccanica di campioni freschi e criopreservati di tessuti di origine murina e umana con il fine di definire il protocollo migliore per studiare il fenotipo dei linfociti T infiltranti tali tessuti, in termini sia di percentuale di cellule positive sia di intensità di fluorescenza. I risultati ottenuti indicano differenze importanti dei diversi approcci di dissociazione a seconda dei diversi tipi di tessuto in termini di recupero numerico delle popolazioni linfocitarie. In conclusione, questo studio suggerisce che, a seconda del tipo specifico di tessuto e dell’utilizzo finale del campione, si debba adottare un protocollo specifico per la preparazione della sospensione cellulare oggetto di approfondimento mediante citometria flusso.

Cancer immunotherapy manipulates the patient’s immune system to recognise and eliminate cancer cells, offering new possibilities for treatment and disease control. It has long been known that tumours are able to ‘silence’ effector T-lymphocytes through immunological brake signals, known as immune checkpoints, and thanks to the presence of immunosuppressive circuits generated by the presence of regulatory T-lymphocytes and suppressive myeloid cells within the tumour infiltrate. Multiparametric flow cytometry is the most widely used technological platform for studying the T-lymphocyte component of the tumour microenvironment in greater detail. To ensure the accuracy and reliability of the results obtained by flow cytometry, it is essential to optimise the protocols for processing biopsies into cell suspensions, which constitutes the pre-analytical stage of the immunophenotyping protocol for lymphocyte populations. The project carried out as part of my thesis analysed the impact on flow cytometric analysis of various protocols for the preservation and enzymatic and mechanical dissociation of fresh and cryopreserved samples of mouse and human tissue, with the aim of identifying the best protocol for studying the phenotype of T lymphocytes infiltrating these tissues, in terms of both the percentage of positive cells and fluorescence intensity. The results obtained indicate significant differences between the various dissociation approaches, depending on the type of tissue, in terms of the numerical recovery of lymphocyte populations. In conclusion, this study suggests that, depending on the specific type of tissue and the intended use of the sample, a specific protocol should be adopted for the preparation of the cell suspension to be analysed by flow cytometry.