Ottimizzazione e validazione di una ricombinasi sito-specifica farmaco-dipendente

Abstract

Attualmente, una delle tecnologie più utilizzate per l’editing genomico è la ricombinazione sito-specifica, che consente di indagare le funzioni geniche in tessuti specifici. Un avanzamento significativo di questa tecnologia è stato ottenuto introducendo un controllo temporale dell’attività delle ricombinasi mediante sistemi inducibili basati sulla somministrazione di farmaci che attivano le ricombinasi in finestre temporali definite. Tra le ricombinasi più utilizzate ci sono la CRE ricombinasi e la ricombinasi flp. In questo contesto si inserisce il mio progetto di tesi che ha come obiettivo la caratterizzazione di una Flp ricombinasi fusa a un dominio di destabilizzazione (FlpO-DD), inducibile con un farmaco, il trimetoprim. Questa ricombinasi è stata da noi ottimizzata tramite una strategia di clonaggio per renderla inducibile in cellule di mammifero. Questa ricombinasi inducibile utilizzata in combinazione con la Cre inducibile dal tamoxifene permette di avere un sistema condizionale inducibile doppio. Per validare il funzionamento della FlpO-DD sono state utilizzate cellule HeLa con integrato Rubik, un reporter molecolare fluorescente in grado di monitorare l’azione delle ricombinasi Cre e Flp esprimendo fluorofori differenti in base alla sequenza temporale degli eventi di ricombinazione. I dati ottenuti hanno mostrato un'efficace induzione della ricombinasi da parte del trimetoprim; tuttavia, è stato osservato anche un certo grado di attività in assenza del farmaco. Pertanto, saranno necessarie ulteriori ottimizzazioni per migliorare la specificità del sistema e ridurne l’attività di fondo.

Currently, one of the most widely used technologies for genome editing is site-specific recombination, which enables precise investigation of gene functions in specific tissues. A significant advancement in this field has been the introduction of temporal control of recombinase activity through inducible systems, in which drugs are administered to activate recombinases within specific time windows. Among the most extensively employed recombinases are Cre and Flp. While the tamoxifen-inducible Cre recombinase is well established and used, a comparable system inducible with another drug for Flp has to be implemented. In this context, my thesis project focuses on the characterization of an optimized Flp recombinase fused to a destabilization domain (FlpO-DD), inducible by trimethoprim. We employed a cloning strategy to obtain a functional inducible Flp recombinase active on mammalian cells. To assess FlpO-DD functionality, we used HeLa cells engineered with Rubik, a fluorescent molecular reporter that monitors Cre and Flp activity by expressing distinct fluorophores depending on the temporal sequence of recombination events. The data we obtained showed an efficient induction of FlpO-DD by trimethoprim; however, a certain degree of recombinase activity was also observed in the absence of the drug. Therefore, further optimisation will be necessary to improve the specificity of the system and reduce its background activity.