Caratterizzazione temporale dell'attività elettrofisiologica di reti neuronali 3D ottenute tramite Bioprinting

Abstract

La caratterizzazione elettrofisiologica di colture neuronali tridimensionali in vitro è una delle tecniche fondamentali per comprendere il funzionamento del cervello e delle sue popolazioni cellulari. In particolare, l’analisi di reti 3D ottenute tramite bioprinting è essenziale per studiarne lo sviluppo, la maturazione e la connettività sinaptica in vivo. In questo contesto, il mio elaborato si inserisce in un progetto più ampio che ha come obiettivo finale la riproduzione in vitro del circuito cortico-talamico-striatale del cervello di ratto: questa tesi, in particolare, si concentra sullo studio della corteccia che modula l’attività degli altri due circuiti, interconnessi tra loro e con la corteccia stessa. Insieme, sono fondamentali per alcune funzioni comportamentali complesse, come spiegato da Brofiga et al. Il cervello è stato prelevato da embrioni di ratto, da cui è stato isolato il tessuto corticale e successivamente dissociato in singole cellule. Queste ultime così ottenute sono poi state sospese in un gel a base di chitosano, sviluppato e testato precedentemente. Il bioinchiostro è stato stampato con l’utilizzo di una biostampante ad estrusione su MEA da 120 elettrodi, processo che ha permesso la maturazione di una struttura 3D complessa. In particolare, mi sono occupata della registrazione dell’attività fisiologica della coltura neuronale dopo 15 e 21 giorni in vitro, in modo da poter valutare l’evoluzione della connettività sinaptica: a DIV15 le reti iniziano ad essere funzionalmente mature, a DIV21 esse lo sono completamente, sia dal punto di vista morfologico che funzionale. Ho successivamente estrapolato i dati a DIV15 e a DIV21, ottenendo quattro parametri fondamentali per lo studio dell’attività dei singoli spike e dei burst. Li ho analizzati e confrontati in MATLAB, con il test non parametrico di Kruskal-Wallis e ne ho ricavato un p-value. Questo valore ha permesso di individuare differenze significative tra le distribuzioni di spike e di burst.

Electrophysiological characterization of three-dimensional neuronal cultures in vitro is one of the fundamental techniques for understanding the function of the brain and its cellular populations. In particular, the analysis of 3D networks obtained through bioprinting is essential for studying their development and synaptic connectivity in vivo. In this context, my thesis is part of a project which the ultimate goal is to reproduce in vitro the cortico-thalamo-striatal circuit of the rat brain. This thesis focuses on studying the cortex, which modulates the activity of the other two interconnected circuits and is itself connected to them. Together, these circuits are crucial for certain complex behavioral functions, as described by Brofiga et al. The brain tissue was collected from rat embryos, from which the cortical tissue was isolated and subsequently dissociated into single cells. These cells were then suspended in a chitosan-based hydrogel, previously developed and tested. The bioink was printed using an extrusion-based bioprinter onto a 120-electrode MEA, a process that enabled the maturation of a complex 3D structure. Specifically, I worked on recording the physiological activity of the neuronal culture after 15 and 21 days in vitro (DIV15 and DIV21), in order to assess the evolution of synaptic connectivity. At DIV15, the networks begin to be functionally mature; by DIV21, they are fully mature, both morphologically and functionally. I then extracted the electrophysiological data at DIV15 and DIV21, obtaining four key parameters for the study of single spikes and bursts. I analyzed and compared these using MATLAB, applying the non-parametric Kruskal-Wallis test, from which I obtained a p-value. This value allowed me to identify statistically significant differences between the distributions of spikes and bursts.