Studi funzionali del mosaicismo di varianti nel gene SCN2A associato a disordini del neurosviluppo

Abstract

Le varianti patogenetiche nel gene SCN2A, che codifica per la subunità α del canale del sodio di tipo 2 voltaggio-dipendente (NaV1.2), causano uno spettro fenotipico che va dall'epilessia neonatale autolimitante (familiare) o autismo all'encefalopatia epilettica e dello sviluppo. Le mutazioni con guadagno di funzione (GoF) causano generalmente crisi convulsive a esordio precoce con buona risposta ai bloccanti dei canali del sodio (BCS), mentre le mutazioni con perdita di funzione (LoF) mostrano epilessia a esordio infantile tardivo senza risposta ai BCS. Abbiamo caratterizzato funzionalmente due varianti del gene SCN2A: c.4976C>T (p.A1659V) e c.710T>A (p.I237N) individuate in quattro pazienti con encefalopatia epilettica infantile precoce (EIEE) e una risposta imprevista agli BCS. Le varianti patogenetiche di SCN2A sono state identificate tramite la tecnica NGS e inserite tramite mutagenesi sito-diretta in un plasmide contenette il cDNA del gene SCN2A stabilizzato che codifica per NaV1.2. L'espressione e la caratterizzazione funzionale delle due varianti sono state eseguite nelle cellule HEK293 tramite western blotting, microscopia confocale ed elettrofisiologia patch-clamp. Le varianti A1659V e I237N non hanno avuto impatto sull'espressione del canale valutata tramite western blot e saggi di immunofluorescenza. Al contrario, quando abbiamo trasfettato i canali mutati, abbiamo registrato, per entrambe le varianti, una corrente inferiore rispetto al canale WT. Quindi, abbiamo identificato due mutazioni LoF che possono causare fenotipi gravi simili alla mutazione di GoF ma senza risposta ai BCS. Il nostro studio fornisce prove di correlazione genotipo-fenotipo oltre a quelle convenzionalmente accettate per i disturbi correlati a SCN2A e rafforza il valore della caratterizzazione funzionale precoce delle varianti per guidare le strategie terapeutiche e la gestione dei pazienti.

Pathogenic variants in the SCN2A gene, encoding for the α-subunit type 2 of the voltage-gated sodium channel (NaV1.2), cause a phenotypic spectrum ranging from self-limited (familial) neonatal epilepsy or autism to developmental and epileptic encephalopathy. Gain-of-function (GoF) mutations generally cause early-onset seizures with good response to sodium channels blockers (SCBs), while loss-of-function’s (LoF) show late infantile onset epilepsy with no response to SCBs. We functionally characterized two SCN2A variants: c.4976C>T (p.A1659V) and c.710T>A (p.I237N) found in four patients with Early Infantile Epileptic Encephalopathy (EIEE) and an unpredicted response to SCBs. The SCN2A pathogenic variants were identified through next generation sequencing and inserted by site-directed mutagenesis in a stabilized SCN2A plasmid encoding for NaV1.2. Expression and functional characterization of the two variants were performed in HEK293 cells by western blotting, confocal microscopy, and patch clamp electrophysiology. The A1659V and I237N variants did not impact on channel expression as shown by western blot and immunofluorescence assays. Conversely, when transfecting the mutated channels, we recorded, for both variants, a smaller current as compared to the WT. WE have identified two LoF mutations can cause severe phenotypes similarly to GoF’s mutation but with no response to SCBs. Our study provides evidence of genotype-phenotype correlation beyond those conventionally accepted for SCN2A-related disorders and reinforces the value of early functional characterization of variants to guide therapeutic strategies and patients’ management.