Metodica di Ibridazione Cromogenica In situ in Anatomia Patologica: sviluppo e validazione del protocollo intralaboratorio e risoluzione dei problemi.

Abstract

INTRODUZIONE: L'ibridazione cromogenica in situ (CISH) è una tecnica citogenetica usata in medicina per rilevare sequenze specifiche di DNA o RNA nei tessuti. Combina l'ibridazione in situ con la rilevazione cromogenica simile all'immunoistochimica, permettendo di localizzare le sequenze geniche nei campioni.

SCOPO DEL LAVORO: L'obiettivo della tesi è sviluppare, ottimizzare e validare un protocollo CISH per l'amplificazione del gene HER-2 in carcinoma mammario ed esofago-gastrico. Si mira a risolvere problematiche tecniche che influenzano l'affidabilità della metodica e garantire che possa supportare le decisioni terapeutiche, come l'uso di trastuzumab nei tumori HER-2 positivi.

MATERIALI E METODI: La metodica CISH è stata introdotta con il sistema Roche Ventana. Il protocollo standard è stato testato su 15 casi retrospettivi, con un'adeguatezza nell'80%. Sono state apportate modifiche al protocollo, riguardanti spessore delle sezioni, tempistiche di digestione enzimatica, diluizione del reagente SSC, decontaminazione dell'autostainer e cambiamento dei reagenti.

RISULTATI E DISCUSSIONI: Le modifiche più rilevanti sono state l'adozione di un cambio settimanale dei reagenti e una decontaminazione periodica dell'autostainer. Il protocollo ottimizzato è stato testato su 25 casi consecutivi con valutazione immunoistochimica di HER-2 score 2+ (positività dubbia). L'80% dei casi ha mostrato adeguatezza nei risultati CISH, con una concordanza perfetta con la FISH (100% nei casi adeguati).

CONCLUSIONI: La metodica CISH ROCHE non ha raggiunto i risultati sperati in termini di adeguatezza (90-95%), ma risulta utile se adattata alle condizioni pre-analitiche del laboratorio. La concordanza tra CISH e FISH è stata perfetta nei casi adeguati, e si proseguirà con un’analisi su una casistica più ampia per confermare l'affidabilità della metodica.

INTRODUCTION:Chromogenic in situ hybridization (CISH) is a cytogenetic technique used in medicine to detect specific DNA or RNA sequences within tissues. AIM OF THE STUDY:The aim of this thesis was to develop, optimize, and validate a CISH protocol for assessing HER-2 gene amplification in breast and gastroesophageal carcinoma. This study has two main objectives: 1) to resolve technical issues that may compromise the reliability of the CISH method, analyzing and improving various critical steps in the protocol (pre-analytical, analytical, and post-analytical phases); 2) to ensure that, through careful optimization, this method can be used as a reliable tool for supporting therapeutic decisions, particularly for patients who may benefit from targeted treatments, such as trastuzumab for HER-2 positive cancers.MATERIALS AND METHODS:The CISH technique was introduced using the Roche Ventana system. The standard protocol was tested on 15 retrospective cases, achieving an adequacy rate of 80%. Several modifications were made to the protocol, including changes to section thickness, enzymatic pretreatment timing, SSC reagent dilution, autostainer decontamination, and reagent changes. RESULTS AND DISCUSSION:The most significant modifications were weekly reagent changes and periodic decontamination of the autostainer. The optimized protocol was then prospectively tested on 25 consecutive cases with immunohistochemical evaluation of HER-2 score 2+ (doubtful positivity) requiring gene amplification assessment. Adequacy was achieved in 80% of cases, with a perfect concordance (100%) between CISH and FISH results in the adequate cases.CONCLUSIONS:The Roche CISH method did not achieve the expected results in terms of adequacy (90-95%), but it can be useful if adapted to the laboratory's pre-analytical conditiotions. There was perfect concordance between CISH and FISH in the adequate cases.