Protocollo di stimolazione per splenociti murini

Abstract

Questo progetto si basa sullo sviluppo e l’ottimizzazione di un protocollo di stimolazione di cellule immunitarie murine, in particolare degli splenociti, che permetta di valutarne in maniera riproducibile la funzionalità attraverso la citometria a flusso. Le cellule sottoposte ai protocolli di stimolazione, che variavano i tempi d'incubazione, le concentrazioni degli stimoli e il monitoraggio dei markers funzionali delle popolazioni T, hanno evidenziato diverse cinetiche dei fattori chiave significativi di attività citotossica. Per analizzare la funzione citotossica complessiva, l’applicazione di protocolli citometrici permette la valutazione simultanea a livello di singola cellula dei livelli di CD107a e granzima B e della produzione della citochina IFN-γ. Sono state impiegate due diverse metodologie di stimolazione: una naturale/specifica e una artificiale. La prima sfrutta, per valutare gli effetti di una stimolazione TCR-mediata, anticorpi monoclonali murini purificati anti-CD3 e anti-CD28; in due modalità: sia con anti-CD3 adeso sulla superficie della piastra, sia con anti-CD3 solubile. Nel secondo caso si usa una stimolazione policlonale con PMA e ionomicina, che attivano pathways intracellulari di signalling , come la proteina-chinasi C tramite PMA e l'aumento del calcio intracellulare tramite ionomicina. Si tratta di un metodo consolidato in citometria a flusso per misurare la produzione di citochine da parte dei linfociti T. I risultati mostrano una diversa responsività alla stimolazione, fornendo informazioni sul potenziale citotossico delle cellule T in vitro. L'obiettivo è quello di ottenere una caratterizzazione sempre più precisa della risposta immunitaria cellulare nei modelli preclinici, costituendo la base per future applicazioni sperimentali e traslazionali.

This project is based on the development and optimization of a protocol for stimulating mouse immune cells, particularly splenocytes, which allows their functionality to be reproducibly assessed through flow cytometry. The cells subjected to the stimulation protocols, which varied incubation times, stimulus concentrations, and the monitoring of functional markers on T cell populations, showed different kinetics of key factors indicative of cytotoxic activity. To analyze overall cytotoxic function, applying cytometric protocols allows the simultaneous evaluation at the single-cell level of CD107a and granzyme B levels and the production of the cytokine IFN-γ. Two different stimulation methods were used: one natural/specific and one artificial. The first uses purified murine monoclonal anti-CD3 and anti-CD28 antibodies to assess the effects of TCR-mediated stimulation, in two ways: either with anti-CD3 bound to the surface of the plate, or with soluble anti-CD3. In the second case, a polyclonal stimulation with PMA and ionomycin is used, which activate intracellular signaling pathways, such as protein kinase C via PMA and intracellular calcium increase via ionomycin. This is a well-established method in flow cytometry to measure cytokine production by T cells. The results show a different responsiveness to stimulation, providing information on the cytotoxic potential of T cells in vitro. The goal is to get an increasingly precise characterization of the cellular immune response in preclinical models, laying the groundwork for future experimental and translational applications.