Studio del Ruolo di Geni Candidati nella Progressione del Glioma mediante l'Inattivazione Genica con CRISPR-Cas9

Abstract

I gliomi sono tumori primitivi del sistema nervoso centrale caratterizzati da aggressività e proprietà immunosoppressive. La loro progressione è studiata mediante un modello murino indotto dalla sovraespressione di PDGF-B, che genera gliomi di basso grado (LGG), non coltivabili in vitro e privi di potenziale tumorigenico, e gliomi di alto grado (HGG), coltivabili in vitro e capaci di formare tumori secondari dopo trapianto ortotopico. Precedenti analisi trascrittomiche e confronti con dataset umani hanno identificato En2, Hoxa5, Ulbp1 e Axl come geni sovraespressi negli HGG murini e umani. Questo studio ha valutato una strategia CRISPR-Cas9 per il targeting di questi geni nelle cellule HGG murine, confrontando trasduzione lentivirale e trasfezione transiente di plasmidi per la somministrazione degli sgRNA. L’editing genomico è stato analizzato mediante PCR, sequenziamento Sanger e Oxford Nanopore. La trasfezione transiente è risultata più efficace della trasduzione lentivirale: per En2 è stata rilevata una delezione ricorrente di circa 200 nucleotidi nella regione codificante, mentre Hoxa5 ha mostrato editing a bassa frequenza e Axl e Ulbp1 nessun editing significativo. Gli effetti della delezione di En2 sono stati valutati analizzando proliferazione, inibizione da contatto e potenziale tumorigenico mediante Incucyte, focus formation assay e trapianto ortotopico in vivo. Le cellule HGG editate per En2 hanno mostrato ridotta proliferazione, apparente recupero dell’inibizione da contatto e, in vivo, una ridotta capacità di formare gliomi. Sebbene siano necessari ulteriori esperimenti, i risultati suggeriscono che la delezione di En2 possa influenzare le proprietà maligne degli HGG, richiedendo una validazione funzionale diretta.

Glioma progression can be studied using a murine model induced by PDGF-B overexpression, which generates low-grade gliomas (LGG), unable to grow in vitro and lacking tumorigenic potential, and high-grade gliomas (HGG), which can be cultured in vitro and generate secondary tumors after orthotopic transplantation. Previous transcriptomic analyses by microarray and RNA sequencing, followed by comparison with publicly available human glioma datasets, identified En2, Hoxa5, Ulbp1 and Axl as key genes overexpressed in both murine and human HGG. This study aimed to develop and evaluate a CRISPR-Cas9 strategy to target these genes in murine HGG cells. Lentiviral transduction and transient plasmid transfection were compared for sgRNA delivery into Cas9-expressing HGG cells. Genome editing was assessed by PCR, Sanger sequencing and Oxford Nanopore sequencing. Lentiviral delivery showed low efficiency and limited editing, whereas transient transfection improved editing, particularly for En2, where a recurrent ~200-nucleotide deletion was detected in the coding sequence. Hoxa5 showed low-frequency editing, while no significant editing was detected for Axl or Ulbp1. The effects of En2 deletion were then investigated by assessing HGG hallmarks: proliferation by Incucyte live-cell imaging, loss of cell-cell contact inhibition by focus formation assay, and tumorigenic potential by preliminary orthotopic transplantation in vivo. En2-edited cells showed reduced proliferation and appeared to recover contact inhibition. In vivo, they also showed a reduced ability to form gliomas, although further experiments are required for confirmation. Overall, transient plasmid transfection was more effective than lentiviral delivery in this model, and the results provide preliminary evidence that the identified En2 deletion may affect HGG malignant properties, although its functional consequences require direct validation.