Generazione e caratterizzazione di modelli motoneuronali in vitro per lo studio dell’ALS

Abstract

La Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA) è una patologia neurodegenerativa caratterizzata dalla degenerazione dei motoneuroni, per la quale non sono ancora disponibili terapie risolutive. In ambito bioingegneristico lo sviluppo di modelli cellulari in vitro rappresenta uno strumento fondamentale per studiarne i meccanismi; in particolare le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) possono essere differenziate in motoneuroni, permettendo di ricostruire e analizzare il processo di maturazione neuronale. Lo studio seguente si propone di quantificare l’espressione di una serie di marcatori del differenziamento neuronale nel corso della maturazione da iPSC verso il fenotipo motoneuronale, a partire da immagini di immunofluorescenza acquisite a diversi giorni in vitro (DIV). A tale scopo ho sviluppato un algoritmo in ambiente Fiji per l'elaborazione delle immagini, la segmentazione delle cellule e la misura dell'intensità di fluorescenza, quantificata tramite il Corrected Total Cell Fluorescence (CTCF). L’analisi è stata fatta sia su marcatori associati agli stadi di progenitori, sia su marcatori neuronali e motoneuronali. L'andamento temporale dell'espressione dei diversi marcatori è stato infine valutato mediante analisi statistica. I risultati confermano un andamento coerente con la progressiva maturazione della coltura verso il fenotipo motoneuronale. Nel complesso, il metodo sviluppato consente di seguire in modo quantitativo l'evoluzione del differenziamento, fornendo uno strumento utile per la caratterizzazione di questo modello cellulare.

Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) is a neurodegenerative disease characterised by the degeneration of motor neurons, for which no resolutive therapies are yet available. In the bioengineering field, the development of in vitro cellular models represents a fundamental tool for studying its mechanisms; in particular, induced pluripotent stem cells (iPSCs) can be differentiated into motor neurons, making it possible to reconstruct and analyse the process of neuronal maturation. The present study aims to quantify the expression of a set of markers of neuronal differentiation over the course of the maturation of iPSCs towards the motor neuron phenotype, starting from immunofluorescence images acquired at different days in vitro (DIV). To this end, I developed an algorithm in the Fiji environment for image processing, cell segmentation and the measurement of fluorescence intensity, quantified through the Corrected Total Cell Fluorescence (CTCF). The analysis was carried out both on markers associated with progenitor stages and on neuronal and motor neuronal markers. The temporal trend of the expression of the different markers was finally evaluated by means of statistical analysis. The results confirm a trend consistent with the progressive maturation of the culture towards the motor neuron phenotype. Overall, the developed method allows the evolution of the differentiation to be followed quantitatively, providing a useful tool for the characterisation of this cellular model.