Studio dell'interazione funzionale tra PRRT2 e i canali del sodio voltaggio-dipendenti nei neuroni granulari del cervelletto

Abstract

“Proline-Rich Transmembrane Protein 2” (PRRT2) è una proteina neurone-specifica che modula il rilascio di glutammato e la fisiologia dei canali del Na+ voltaggio-dipendenti (Nav). Mutazioni con perdita di funzione causano discinesia parossistica chinesigenica, probabilmente causata da disfunzione cerebellare, data l'elevata espressione di PRRT2 nelle cellule granulari del cervelletto (GC). I GC PRRT2 KO mostrano un'aumentata espressione dei Nav e maggiore eccitabilità intrinseca. Questa tesi presenta un metodo computazionale per l'analisi quantitativa di registrazioni elettrofisiologiche che è stato applicato allo studio della funzionalità dei Nav nei GC. È stata sviluppata una pipeline MATLAB per automatizzare il rilevamento degli spike, l'analisi dell'attività di scarica e la caratterizzazione dei potenziali d'azione (AP) mediante analisi del phase plot, consentendo l’estrazione di parametri biofisici. Il knockdown di Nav1.6 ha ridotto la densità di corrente di Na+, con un effetto maggiore nelle GCs PRRT2 KO, indicando che l'aumento della corrente è principalmente dovuto a una maggiore espressione funzionale di Nav1.6. Il silenziamento di Nav1.6 ha ripristinato la frequenza di scarica istantanea delle GCs PRRT2 KO, identificando Nav1.6 come principale responsabile dell'ipereccitabilità. Dall'analisi degli AP è emerso un aumento dell'ampiezza e del picco del AP delle GCs PRRT2 KO. L'analisi del phase plot ha identificato uno shift verso profili monofasici, coerente con un alterato inizio dell’AP nel monticolo assonico, ripristinato dal knockdown di Nav1.6, indicando che l'aumentata espressione di Nav1.6 contribuisce all'anomalo inizio dell’AP nel PRRT2 KO. Nel complesso, Nav1.6 emerge come un elemento chiave dell’ipereccitabilità PRRT2-dipendente e dimostra che la pipeline costituisce uno strumento valido per l'estrazione rapida di caratteristiche biofisiche complesse, con ampia applicabilità allo studio dell'eccitabilità cellulare.

Proline-rich transmembrane protein 2 (PRRT2) is a neuron-specific protein modulating glutamate release and voltage-gated Na+ (Nav) channel physiology. Loss-of-function mutations cause paroxysmal kinesigenic dyskinesia, likely involving cerebellar dysfunction, given its high expression in cerebellar granule cells (GCs). PRRT2 KO GCs show increased Nav expression and enhanced intrinsic excitability. This thesis presents an automated computational method for quantitative analysis of whole-cell patch-clamp recordings which was applied to study Nav function in GCs. A MATLAB-based computational pipeline was developed and optimized to automate spike detection, firing analysis, and action potential (AP) characterization through phase-plane plot analysis, enabling rapid, reproducible extraction of biophysical parameters. Selective Nav1.6 knockdown significantly reduced Na+ current density, with a stronger effect in PRRT2-KO than in WT neurons, indicating that the increased Na+ current in PRRT2 KO cells is mainly driven by enhanced functional Nav1.6 expression. Nav1.6 silencing also abolished the increased instantaneous firing frequency in PRRT2 KO GCs, identifying Nav1.6 as the main driver of the hyperexcitability associated with PRRT2 loss. The automated AP analysis revealed increased AP amplitude and peak voltage in PRRT2-KO neurons. Phase-plane analysis identified a shift towards monophasic waveforms in PRRT2 KO GCs, consistent with altered AP initiation at the axon initial segment, partially restored by Nav1.6 knockdown, indicating that increased Nav1.6 expression contributes to abnormal AP initiation in PRRT2-KO cells. Overall, this work identifies Nav1.6 as a key driver of PRRT2-dependent hyperexcitability and shows that the automated analysis pipeline provides a robust, reproducible, and sensitive framework to extract complex biophysical features, with broad applicability to studies of cell excitability beyond PRRT2-related disorders.