Studi funzionali di varianti non caratterizzate del gene SCN8A associate ad encefalopatie epilettiche.

Abstract

Le encefalopatie epilettiche sono un gruppo eterogeneo di gravi malattie neurologiche infantili, spesso permanenti, caratterizzate da crisi resistenti ai farmaci, regressione e deficit cognitivi. Tra queste, quelle dovute a varianti del gene SCN8A, che codifica il canale del sodio NaV1.6, risultano particolarmente severe. Poiché i canali del sodio sono essenziali per la trasmissione degli impulsi nervosi, varianti in SCN8A alterano l’eccitabilità neuronale e causano crisi. La manifestazione clinica è molto variabile e le correlazioni genotipo–fenotipo sono ancora poco comprese. Questa tesi ha studiato i meccanismi molecolari e cellulari delle encefalopatie da SCN8A con l’obiettivo di sviluppare terapie personalizzate. Una nuova variante, p.I763V NaV1.6, riscontrata in bambini seguiti all’IRCCS Gaslini, è stata analizzata in sistemi eterologhi tramite patch-clamp, confrontando canali sani e mutati. Sono emerse alterazioni nei meccanismi di attivazione, inattivazione e recupero. Parallelamente, fibroblasti da un donatore sano sono stati riprogrammati in cellule staminali pluripotenti e differenziati in neuroni corticali eccitatori mediante Neurogenin-2, creando colture stabili per esperimenti funzionali. Per simulare meglio l’ambiente cerebrale, i neuroni sono stati co-coltivati con astrociti di ratto, ottenendo un sistema biologicamente rilevante per test elettrofisiologici. Analisi future utilizzeranno matrici multielettrodo ad alta densità per studiare scariche, sincronia e connettività neuronale. Realizzato in collaborazione tra l’Unità di Genetica Medica dell’IRCCS Gaslini e l’Istituto di Biofisica del CNR, questo lavoro integra approcci genetici, cellulari e biofisici e pone le basi per future terapie di precisione nelle encefalopatie epilettiche.

Epileptic encephalopathies are a heterogeneous group of severe and frequently permanent childhood neurological illnesses featuring drug-resistant seizures, regression, and frequent permanent cognitive impairment. Sodium channels have a fundamental role in the initiation and propagation of nerve impulses, and variants have a strong tendency to disrupt neuronal activity, triggering seizures. Clinical presentation is remarkably heterogeneous, including loss- and gain-of-function mechanisms, and genotype–phenotype correlations remain poorly understood. This thesis explored the molecular and cellular mechanisms of SCN8A epileptic encephalopathies in order to search for patient-specific therapeutic strategies. A new, never described variant, p.I763V NaV1.6, was studied in heterologous systems through patch-clamp recordings, analyzing the biophysical properties of normal and variant channels. The results showed alteration of activation, inactivation, and recovery processes. In parallel, induced pluripotent stem cells were generated from healthy donor’s fibroblasts and differentiated into cortical excitatory neurons via Neurogenin-2, providing stable cultures that could be subjected to functional experiments. To create a more brain- like environment, these neurons were co-cultured with rat astrocytes, creating a biologically pertinent model for electrophysiological investigation. Future studies, using high-density multielectrode arrays, will be capable of analyzing both single-cell properties and network activity, with a focus on firing patterns, synchrony, and connectivity. Conducted in collaboration between the IRCCS Gaslini Medical Genetics Unit and the CNR Institute of Biophysics, this work combines genetic, cellular, and biophysical approaches, opening the way for precision therapies in epileptic encephalopathies and new possibilities for personalized treatment.