Colture neuronali primarie 2D e 3D: elettrofisiologia su MEA e rilascio di glutammato

Abstract

Gli studi di neurosviluppo, neurotossicità e patologie neurodegenerative hanno una rilevanza per identificare deficit che incidono sul funzionamento del sistema nervoso centrale e sulla qualità della nostra vita. Questa tesi esplora aspetti funzionali fondamentali in un modello cellulare in vitro, come una coltura cellulare primaria organizzata tridimensionalmente (3D) nello sferoide (neurosferoide). Sono stati impiegati diversi approcci sperimentali: i) si è applicato un protocollo di immunofluorescenza per una tipizzazione cellulare e una caratterizzazione dell’architettura del modello; ii) gli aspetti funzionali sono stati valutati attraverso l’elettrofisiologia extracellulare non invasiva, usando dispositivi idonei per registrare l’attività elettrica cellulare spontanea o evocata, e lo studio del rilascio del neurotrasmettitore glutammato. I risultati evidenziano come i neurosferoidi primari siano formati da neuroni e astrociti, organizzati spazialmente in modo da ricreare contatti cellulari fondamentali, le sinapsi, e permettendo una organizzazione dell’attività elettrica e una dinamica del microambiente extracellulare che si avvicina ad in altri modelli ex vivo quali le fettine di tessuto nervoso. Gli sferoidi sembrano quindi rappresentare un modello per lo studio di eventi fisiologici complessi, esempio la neurotrasmissione glutammatergica, le sue possibili alterazioni patologiche. I modelli 3D potrebbero essere resi ancora più compositi e realistici per meglio simulare l'interazione neuronale e gliale in contesti fisiologici e patologici includendo co-colture di ulteriori tipi cellulari o derivanti da diverse aree cerebrali, oppure avvalendosi di tecnologie avanzate come la biostampa 3D, rendendoli strumenti performanti per gli studio di neurosviluppo, neurotossicità e per lo sviluppo di nuove terapie neuroprotettive. Questa attività di tesi è stata svolta presso il laboratorio della sezione di Farmacologia e Tossicologia del DIFAR, in stretta collaborazion

The study of neurodevelopment, neurotoxicity and neurodegenerative diseases is important to identify deficits that affect the function of the central nervous system and our quality of life. This thesis characterizes fundamental functional aspects of an in vitro cell model, such as cortical primary cell culture organized in a three-dimensional (3D) spheroid (neurospheroid). A variety of experimental approaches have been used: (i) an immunofluorescence protocol to assess cell typing and architecture; (ii) non-invasive extracellular electrophysiology experiments to record spontaneous or evoked cellular electrical activity, and glutamate neurotransmitter release assays to obtain a functional characterization. The results show that primary spheroids are constituted by neurons and astrocytes, exhibiting a spatial organization that enables the recreation of fundamental cellular contacts, namely synapses. This organization gives rise to a specific pattern of electrical activity and a dynamic of the extracellular microenvironment. In this regard, the model results closed to other ex vivo models, such as nerve tissue slices. Therefore, spheroids represent an appropriate model for the study of complex physiological processes, such as glutamatergic neurotransmission and its potential pathological alterations. Incorporation of additional cell types, or cells form other brain regions, as well as advanced technologies such as 3D bioprinting, could enhance the realism of 3D models. This would facilitate the simulation of neuronal and glial interactions in physiological and pathological contexts, thereby rendering them invaluable tools for the investigation of neurodevelopment, neurotoxicity and the development of novel neuroprotective therapies. This laboratory activity was conducted at the Pharmacology and Toxicology laboratory of DIFAR, in collaboration with 3Brain AG.