Structure-based discovery di nuovi inibitori delle PDE4D: studio preliminare

Abstract

Le fosfodiesterasi 4 (PDE4) sono una famiglia di enzimi deputati alla scissione dei legami fosfodiesterici dell’adenosina monofosfato ciclico (cAMP), secondo messaggero implicato nella regolazione di molte risposte fisiologiche. Inibitori selettivi di diverse isoforme di PDE4 sono stati studiati per il trattamento di diverse patologie, in particolare per malattie neurodegenerative e cognitive quali malattia di Alzheimer, ma anche malattie autoimmuni, polmonite cronica ostruttiva e depressione. Lo scopo di questa tesi sperimentale è stato lo studio cristallografico, effettuato nel laboratorio del Prof. Parisini presso il Latvian Institute of Organic Synthesis a Riga (Lettonia), di una libreria di composti (28 derivati), sintetizzati a Genova (Dipartimento di Farmacia, Università degli studi di Genova). Questi composti sono stati disegnati e sintetizzati a partire da una grossa libreria di molecole (GEBR-library), molte delle quali avevano mostrato una buona capacità di inibizione delle PDE4D e buona attività in vivo in modelli murini nel migliorare la memorizzazione, senza evidenziare i tipici effetti collaterali (nausea e sedazione) degli inibitori non selettivi. L’argomento di questa tesi sperimentale è la caratterizzazione strutturale della interazione di questi potenziali inibitori con la proteina target mediante diffrazione di raggi X. A tale fine, mi sono occupata della espressione e della successiva purificazione del dominio catalitico della PDE4D, oltre che della sua cristallizzazione in forma apo. Successivamente, utilizzando i cristalli di proteina così ottenuti, ho condotto esperimenti di soaking utilizzando tutti i 28 potenziali inibitori facente parte della nuova GEBR-library precedentemente descritta.

Phosphodiesterase 4 (PDE4) are a family of enzymes responsible for breaking down phosphodiester bonds in cAMP, a second messenger involved in the regulation of many physiological responses. Selective inhibitors of different isoforms of PDE4 have been developed for the treatment of various conditions, particularly neurodegenerative and cognitive diseases such as Alzheimer's disease, as well as autoimmune diseases, chronic obstructive pulmonary disease, and depression. The purpose of this experimental thesis was the crystallographic study, conducted at Prof. Parisini's laboratory at the Latvian Institute of Organic Synthesis in Riga, Latvia, of a library of compounds (28 derivatives) synthesized in Genoa, Italy (Department of Pharmacy, University of Genoa). These compounds were designed and synthesized from a large library of molecules (GEBR-library), many of which had shown good PDE4D inhibition capacity and significant in vivo activity in improving memory without displaying the typical side effects (nausea and sedation) of non-selective inhibitors. The focus of this experimental thesis was the expression and subsequent purification of the catalytic site of PDE4D and its crystallization, followed by soaking experiments with all 28 potential inhibitors belonging to the previously described new GEBR-library.