Applicazione di un nuovo metodo fluorescente per lo studio della fibrosi cistica mediante la misurazione della funzionalità di CFTR in leucociti umani.

Abstract

La fibrosi cistica è una malattia ereditaria multiorgano, caratterizzata dalla mutazione del gene CFTR. Le mutazioni che interessano tale gene sono più di duemila e sono state classificate in sei classi, sulla base dei difetti molecolari e delle conseguenti alterazioni funzionali. A seconda del tipo di mutazione, la proteina può essere più o meno espressa e funzionante, comportando diversi gradi di gravità della malattia. La ricerca effettuata fino ad oggi per cercare di curare il difetto di base ha portato a buoni risultati, ma non sufficienti, per cui si sta sempre più indirizzando verso la validazione di farmaci potenziatori dell'attività di CFTR. Per poter far ciò, è necessario affidarsi ad un metodo facile e veloce e a cellule primarie direttamente prelevate da singoli pazienti. Dato che i leucociti rappresentano una fonte facilmente accessibile di cellule primarie e i dati in letteratura li riconoscono come componente chiave degli eventi patogenetici associati alla fibrosi cistica, Il nostro laboratorio ha sviluppato un metodo per misurare l'attività di CFTR applicabile a questo modello cellulare. Il risultato di questo metodo si basa sulla quantità residua di ioduro presente nel surnatante, dopo opportuna stimolazione, quantificata dall’ estinzione della fluorescenza di un mutante della yellow fluorescent protein. La specificità del dosaggio per l'attività CFTR è stata testata su cellule FRT che non esprimono CFTR (FRT nulle) e FRT trasfettate per il gene (FRT wt) e in cellule MM6, in seguito trattate con due diversi inibitori CFTR, CFTR-172 e PPQ-102. Questi dati sono stati infine confermati anche nei leucociti primari, dove è stata registrata una differenza significativa tra PBMCs wt e PBMCs FC. Il dosaggio GST-HS-YFP può rappresentare un metodo semplice e veloce per misurare la funzione CFTR nei leucociti da pazienti CF durante gli studi clinici e un'altra tecnica utile per lo screening di nuovi farmaci su pazienti Fc con differenti mutazioni di CFTR.

Cystic fibrosis is a multi-organ hereditary disease characterized by mutation of the CFTR gene. The mutations affecting this gene are more than two thousand and have been classified into six classes, based on molecular defects and consequent functional alterations. Depending on the type of mutation, the protein can be more or less expressed and functioning, resulting in varying degrees of severity of the disease. Research is directing towards the validation of drugs enhancers of CFTR activity. In order to do this, it is necessary to rely on an easy and fast method and primary cells directly taken from individual patients. Leukocytes are an easily accessible source of primary cells and data in the literature recognise them as a key component of the pathogenic events associated with cystic fibrosis, so our laboratory has developed a method to measure the CFTR activity applicable to this cell model. The result of this method is based on the residual amount of iodide present in the supernatant, after appropriate stimulation, quantified by the extinction of the fluorescence of a mutant of yellow fluorescent protein. The specificity of the assay for CFTR activity has been tested on FRT cells that do not express CFTR, then transfected for the human gene and on MM6 cells, subsequently treated with two different CFTR inhibitors, CFTR-172 and PPQ-102. Finally, these data were also confirmed in primary leukocytes, where there was a significant difference between PBMCs WT and PBMCs FC. The GST-HS-YFP dosage can be a simple and fast method to measure CFTR function in leukocytes by CF patients during clinical trials and another useful technique for screening new drugs on FC patients with different mutations of CFTR.