Eterodimeri A2A-D2 in astrociti striatali: evidenze fisiche

Abstract

Sui neuroni striatali l’evidenza dell’esistenza di un’interazione tra recettori dell’adenosina A2A e della dopamina D2 e di eteromeri A2A-D2, ampliò le prospettive di indagine sugli aspetti meccanicistici e molecolari correlati alla patogenesi di disordini neuropsichiatrici (eg. schizzofrenia) e nella malattia di Parkinson. Considerata l’importanza crescente attribuita alla glia in queste patologie e il suo ruolo nella vulnerabilità alla neurodegenerazione, si è deciso di indagare l’espressione di questi protomeri, l’esistenza di interazione recettoriale e di eteromeri A2A-D2 in processi astrocitari isolati (gliosomi) e fettine striatali preparati da ratto adulto. Precedentemente sui gliosomi erano state raccolte evidenze dell’esistenza di recettori funzionali A2A e D2 capaci di modulare il rilascio di glutammato. Dal punto di vista funzionale la prova dell’esistenza dell’eteromero era stata ottenuta usando il peptide interferente VLRRRRKRVN (corrispondente alla regione del D2 coinvolta nell’interazione elettrostatica con A2A, interazione alla base dell’eteromerizzazione A2A-D2). In questa tesi, invece, sono riportate le prove dirette dell’interazione fisica tra i protomeri e la dimostrazione definitiva dell’esistenza di eteromeri A2A-D2 in astrociti striatali. Gli esperimenti di co-immunoprecipitazione dei recettori A2A e D2 da gliosomi dimostrano la loro co-espressione in complessi molecolari presenti sulla membrana plasmatica degli astrociti. Gli esperimenti di immunofluorescenza condotti su fettine con la tecnica proximity ligation assay (PLA) hanno dimostrato che la distanza tra i due recettori è inferiore a 17nm, valore considerato limite affinché possa esistere una interazione fisica tra essi. In conclusione, in questa tesi sono riportate le prove che hanno permesso di dimostrare l’interazione fisica tra A2A e D2 e la loro capacità di esistere in un eteromero funzionale con un ruolo fondamentale a livello dei processi astrocitari striatali.

At the striatal neurons the adenosine A2A and dopamine D2 receptor-receptor interaction (RRI) have opened up new perspectives on the molecular mechanisms related to neuropsychiatric disorders pathogenesis (e.g. schizophrenia) or Parkinson's disease. Since the importance of glial involvement in neuropsychiatric or neurodegenerative disease vulnerability is being increasingly recognized, the expression and the functional role of RRI on the astrocytes and on their processes (gliosomes) isolated from adult rat striatum were investigated. To this aim, biochemical analysis and immunoassay were performed to demonstrate the existence of the A2A-D2 heteromers on striatal astrocytes and on gliosomes. Previously, on gliosomes were obtained evidence on glutamate release and the modulation mediated by A2A and D2 receptors. On gliosomes, the A2A-D2 RRI was assessed by the interference of the synthetic peptide VLRRRRKRVN (corresponding to the D2 region involved in electrostatic interaction underlying A2A-D2 heterodimerization). In this thesis I report the direct biochemical and biophysical data providing the evidence of the A2A-D2 RRI and heteromerization. The co-immunoprecipitation experiments on A2A and D2 receptors in astrocyte processes demonstrated their co-expression on the astrocytic plasma membrane. The proximity ligation assay (PLA), used to assess heteromerization of native receptors, was able to detect their strict co-localization (less than 17 nm) on astrocytes in adult striatal slices. In conclusion, our findings indicate, for the first time, not only that A2A and D2 receptors physically and functionally interact but also that they form heterodimers that could play a crucial integrative role at the striatal astrocyte processes.